《HPLC仪器》PPT课件

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1、高效液相色谱法(HPLC)highperformanceliquidchromatograph2021/7/26高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压驱动流动相、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。概述2021/7/26发展：1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷

2、瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。2021/7/26高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。2021/7/261970年后，适合分离生物大分子的填料又成为研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为色谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动相的组成事提高选择性的关键。2021/7/2

3、6一、HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1．经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1-3cm，固定相粒径>100μm且不均匀常压输送流动相柱效低（H↑，n↓）分析周期长无法在线检测2．HPLC：分离和分析柱内径2-6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）高压输送流动相柱效高（H↓，n↑）分析时间大大缩短可以在线检测2021/7/262021/7/26二、HPLC与GC差别1．分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥

4、发性和热稳定性的限制,分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测,用途广泛，占有机物的80%2021/7/26相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别2021/7/262．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）2021/7/26高效液相色谱仪

5、的结构示意图：一般可分为五个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统,检测系统和数据处理及控制系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。第三节高效液相色谱仪2021/7/262021/7/26第三节高效液相色谱仪2021/7/262021/7/262021/7/26Agilent1200液相色谱系统2021/7/26液相色谱仪（4）2021/7/26高效液相色谱仪的仪器流程(processandmainassemblyofHPLC)高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据采集和控制系统2021/7/261.高压输液系统高压输液泵:主要部件之一，

6、压力：15～35MPa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性（动画）(二).主要部件2021/7/26流动相的预处理：在使用前必须进行脱气处理，以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡抽真空脱气吹氦脱气加热回流脱气超声波脱气2021/7/26等强度洗脱（isocratic):样品的组成较简单，各组分的分配系数值相差不大。在同一分析周期内流动相的组成保持恒定。梯度洗脱（gradient)：样品的组成较

7、复杂，各组分的分配系数值相差大，即宽分配比的组分流动相的洗脱方式2021/7/26●梯度洗脱的特点●梯度洗脱的主要条件●梯度洗脱的基本原理梯度洗脱（溶剂程序）：在同一个分析周期内按一定的程序改变流动相的组成,从而改变流动相极性、离子强度、pH，来调整组分的k值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。梯度洗脱（gradient)2021/7/261．梯度洗脱的特点（1）提高分离度，加快分析速度；（2）改善峰形,减少拖尾,（3）提高检测的灵敏度，有利于痕量组分的检测；（4）增加峰容量；（5）强烈滞留的组分不容易残留