《核酸分子杂交》PPT课件

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1、核酸分子杂交一、概念：1、分子杂交（hybridization):有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补退火形成稳定的双链分子的过程。2、印迹（bloting）：将DNA、RNA或蛋白质固定到固体支持物上的过程。3、探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。4、种类：固相杂交（solid-phasehybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。液相杂交（solutionhbrid

2、ization）指使变性的待测核酸单链与已知的核酸单链（探针）在溶液中保温，使之形成杂交复合物。DNA与DNA杂交DNA与RNA杂交RNA与RNA杂交5、几种常见的杂交：分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：(1)Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。(2)Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或

3、尼龙膜，然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。二、Southern杂交1、步骤：Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤:(1)酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。(2)将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。(3)预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。(4)让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。(5)通过显影检查目的DNA所在的位置。Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素，包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性

4、、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下，放射自显影曝光数天后,Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32P标记的高比活性探针的(>109cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交，曝光过夜，则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。2、固体支持物的种类：带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维膜、PVDF膜尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2

5、，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。3、转膜的方式：将DNA

6、从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:(1)毛细管转移。本方法由Southern发明，故又称为Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用，可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大，温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时，才采用电泳转移。(3)真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上，再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流下，

7、洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速，在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛细转移要高。4、毛细管转移法转膜用的溶液：（1）高盐溶液：1.5MNaCl（2）0.4NNaOH如果DNA分子大，可以用0.25NHCL处理或用紫外线处理，将DNA分子适当打断，以提高转移的效果，注意处理的时间