《核酸分子杂交》PPT课件

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1、现代分子生物学大实验实验三总RNA的提取与Northern杂交实验目的掌握植物总RNA的提取及凝胶电泳检测的原理及方法并能熟练操作对于不同的植物组织，选取不同的提取方法，提取植物的总RNA重点掌握Northern杂交基本原理、基本实验步骤和检测方法利用Northern杂交检测目的基因的时空表达情况，如不同生长发育阶段、不同的组织部位、不同生长环境等条件下相关基因的表达情况植物总RNA的提取及电泳检测掌握植物总RNA的提取及凝胶电泳检测的原理掌握植物总RNA提取的方法并熟练操作用甲醛变性凝胶进行电泳，检测总RNA提取质量对于不同的植物组织，选取不同的提取方法，提取植

2、物的总RNA实验原理细胞破碎，核酸溶出液氮速冻后，对植物组织进行研磨可以破碎细胞。细胞提取液可溶出核酸。核酸的纯化DNA的去除酚、氯仿抽提使蛋白质变性、沉淀，可去除蛋白。多糖、次生代谢物核酸的保护（内源RNA酶）低温、苯酚、氯仿、SDS可以部分抑制RNA酶的活性，保护RNA不被酶解。实验设备常规设备移液器，tip头，离心机RNA电泳金属浴，水平凝胶电泳仪，微波炉，紫外凝胶成像系统紫外分光光度计实验试剂RNA提取液100mmol/LTris–ClpH8.520mmol/LEDTApH8.50.2MNaCl1%SDSβ-巯基乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇琼脂糖

3、、MOPS、EB替代品实验步骤新鲜植物材料液氮研磨抽提液混匀酚/氯仿抽提水层中间层有机层加入异丙醇沉淀干燥水融反复抽提实验步骤向1.5mL离心管中加入700LRNA提取液，35µL的β-巯基乙醇（终浓度5%）。取适量材料，在液氮充分研磨成粉末后，装入离心管中，用力充分混匀。加入苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）各350µL，混匀10min，4℃8000rpm离心10min。取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），摇床震荡10min，4℃8000rpm离心10min。取上清，加入等体积的异丙醇和1/10体积的5mol/LNaCl，充分混匀。-20℃放置

4、20min后4℃，12000rpm离心10min。弃上清，70%乙醇洗沉淀，离心，4℃12000rpm离心5min。弃上清，通风橱内干燥沉淀。沉淀溶于20µL灭菌水中，备用。五、实验步骤RNA浓度测定取1ulRNA样品，加水199ul后读取260nm处的吸光度值260nm处的吸光度值相当于40µg/ml单链RNA，以此来计算样品含量。260nm和280nm读数比值（A260/A280）可反映核酸的纯度纯品的A260/A280的值为2.0，低于A260/A280，有蛋白质或酚的污染。实验步骤RNA电泳RNA变性处理1ulRNA样品加入2.5ul上样缓冲液，混匀后65

5、℃温育5-10min置于冰上冷却（20ulRNA+50ul上样缓冲液）检测RNA的凝胶要配制MOPS甲醛电泳缓冲液为1×M0PS实验步骤用透明胶带将胶板的两端封好。配制0.8%的琼脂糖凝胶（1.6g琼脂糖于500ml三角瓶中，加入1×MOPS200ml），在微波炉中加热至琼脂糖溶解。10×MOPS（MOPS0.2M，NaAC50mM，EDTA10mM，pH7.0）待溶液冷却至60℃左右，加入10ml甲醛，4ulEB替代品充分混匀。放置合适大小的梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在3-5mm之间，大约需要凝固20min。注意事项特别要注意的是在所有器具严格

6、消毒，实验过程中需要带手套，减少说话和走动等防止RNase的污染，来保证RNA不被降解。分子杂交核酸分子杂交，其中又包括Southern杂交及Northern杂交。属于蛋白质分子“杂交”的Western杂交。核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列(或某一区段互补)的两条多核苷酸链，通过Watson—Crick碱基配对形成稳定的双链分子的过程。杂交的双方是待测核酸及探针（probe）待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是基因组DNA或总RNA被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。实验原理－分子杂交植物材料RNADNA合成探针Sou

7、thern杂交Northern杂交原位杂交组织切片分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定，及检测外源基因整合及表达的强有力的手段。要证明外源基因在植物染色体上整合的最可靠的方法是，只有经分子杂交鉴定过的植物才可以称为转基因植物。同时也可以利用Northern杂交来检测不同生长发育阶段和不同的组织部位相关基因的表达情况。实验原理－分子杂交Northern杂交是以DNA或RNA为探针，检测RNA链，用于外源基因转录产物特异mRNA的检测。将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，不同的RNA分子将按分子量大小依次排布在凝胶上，将它们原位转移到固相膜上，在适宜的

8、离子强度及