《核酸分子杂交技术》ppt课件

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1、核酸分子杂交技术李如波中国医科大学法医学院核酸分子杂交技术(Nucleicacidmolecularhybridi-zation)是检测核酸分子间序列同源性的一种技术。不同来源的核酸单链只要彼此间有一定的互补序列，即可按碱基配对规则以氢键相结合。通常是先对一种核酸进行标记（如放射性同位素35S，32P或生物素等）作为探针，去探测另一种核酸序列。核酸分子杂交可以在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行。由于这种技术具有高度的特异性和灵敏性，已广泛应用于生物学、医学科学研究，临床传染病和遗传病

2、的诊断。一、核酸分子杂交的基本原理从化学和生物学意义上理解，探针(Probe)是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并仅与特异靶分子反应。抗原-抗体、外源凝集素-碳水化合物、亲和素-生物素、受体-配体(ligand)以及互补核酸间的杂交均属于探针-靶分子反应。蛋白质探针（如抗体）与特异靶分子是通过混合力（疏水、离子和氢键）的作用在少数特异位点上的结合，而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同，通过氢键在几十、几百甚至上千位点上的结合。核苷酸经某一原子、功能基团或长侧链修饰后仍有可能进行碱基配对

3、，这取决于修饰的部位和修饰物的性质。标记的探针每1kb只掺入10-30个修饰碱基，仅4％-12％的单个碱基被修饰的类似物取代。尽管掺入位点处的碱基配对较弱或不存在，但对整个杂交分子的稳定性影响很小。二、核酸探针的种类根据标记方法不同可分为：放射性探针非放射性探针根据核酸的性质不同又可分为：DNA探针单链(ssDNA)双链(dsDNA)RNA探针cDNA探针cRNA探针原位杂交可分为DNA-DNA，cDNA-RNA，RNA-RNA和寡核苷酸与DNA或RNA等杂交方式。三、核酸探针的标记和检测最早采用也是目前最

4、常用的核酸标记方法是放射性同位素标记，常用的放射性同位素有32P和35S，前者能量高，信号强，最常用。放射性同位素探针虽然灵敏性高，但却存在辐射危害和半衰期限制。由于存在上述缺点，近年来，人们在寻求非放射性标记物方面取得了很大进展。国际上已有多家公司相继推出多种非放射性探针标记试剂盒，在国内也具备生物素类标记物的生产能力，并有相应试剂出售。目前非放射性标记物有以下几类：金属如Hg；荧光物质如FITC；半抗原如地高辛（DIG）；生物素；酶类如辣根过氧化物酶（HRP）；半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（AKP）等。四、核

5、酸探针标记及显示方法（一）核酸探针的放射性标记技术1.缺口平移标记方法（nicktranscription）原理：首先用DNA酶在双链DNA探针的一条链上制造一个缺口（nick），缺口处形成3’-羟基末端，在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’-羟基本上。同时根据大肠杆菌DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶将缺口5’端核苷酸依次切除，其结果是在缺口的5’端不断消除核苷酸而在3’端则依次添加核苷酸，从而使缺口沿着互补DNA链移动，故称缺口平移。根据这个原理，用α-32PdATP置换先前

6、存在的核苷酸，则可制备高活性的DNA探针，能满足大多数杂交的要求。2.DNA快速核酸标记大肠杆菌聚合酶I经枯草杆菌酶切割可得到两条多肽链，其中分子量为76kD的大片断称为Klenow片段。该酶具有完整聚合酶I的5’→3’核酸聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，但缺乏5’→3’核酸外切酶活性。利用Klenow片段可以填补由限制性酶消解DNA所产生的3’凹陷末端。因此，用这种方法可以标记双链DNA的凹陷3’末端。用Klenow片段标记末端一般只用一种[α-32P]dNTP，加入反应的[α-32P]dNTP取决

7、于延伸的5’末端序列。3.用T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端寡核苷酸探针或短的RNA和DNA探针可选用此方法。T4多核苷酸激酶(polynucleotidekinase,PNK)是由T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸转移至DNA或RNA的5’-OH末端。在过量ADP存在时，也可促进磷酸交换反应，使PNK将DNA末端5’磷酸转移到5ADP上生成ATP，然后催化[α-32P]dNTP上的标记磷酸转移至DNA的5’末端，从而使DNA重新磷酸化，并得到标记。注意要用碱性磷酸酶去掉磷酸基团

8、。4.随机引物延伸标记方法是从单链DNA或RNA模板合成高比活性的32P标记探针所选用的方法。原理:使长6-8nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I的作用下，以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNA链的合成，在反应时将α-32PdNTP掺入合成链，即得到标记。变性处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小的探针DNA。因为所用真核苷酸片段很短，在低温条件下可与