检测孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断的初步研究

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1、硕士掌位论文检测孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断的初步研究中文摘要检测孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断的初步研究硕士研究生吴菁导师黄艳仪教授陈小蔓副主任医师摘要近几十年来，遗传病和先天畸形的发病率相对升高，对人类健康的威胁已日益严重。众所周知很多遗传性疾病和先天畸形是无法治愈的，要求在产前做出诊断，及早采取适当的措施。降低出生缺陷率。目前I临床上产前诊断的取材方法大多是创伤性的，它们对产妇和胎儿都不同程度的存在着流产、感染等不安全的因素，故产前诊断的对象仅限于某些高危妊娠的孕妇，对整个人群出生缺陷率的降低意义不大。多年来许多学者一直

2、探求将非创伤性的方法用于产前诊断，使之可以应用于大规模的人群，降低出生缺陷率，对于提高人口素质具有重大意义。在妊娠期间胎儿的血液循环和母体的血液循环被胎盘膜隔开，但各种证据显示母血中存在着胎儿细胞，表明胎盘并不能完全阻碍细胞通行，这就提示可以利用母体血液作为产前诊断胎儿疾病的底物。受到肿瘤病人血浆中存在肿瘤DNA的启发，Lo等(1997年)开始在母体血浆和血清中寻找胎儿DNA，他们用普通PCR的方法，在怀有男性胎儿的孕妇血浆和血清DNA中扩增出特异性Y染色体DNA序列，首次证实了孕妇血浆和血清中存在胎儿DNA，表明孕妇血浆和血清

3、是胎儿DNA和母体DNA的嵌合性混合物，提示孕妇血浆中的DNA是进行非侵入性产前诊断的另一种有价值的底物。1998年Lo用实时定量PCR技术通过检测孕妇血清和血浆中性别决定Y(sex_detenniningregion，SRY)基因，测定了胎儿DNA的浓度，发现胎儿DNA的绝对浓度随孕龄而增高，并在妊娠期末急剧升高，而且在孕7周就可以在母体血浆中检测到胎儿DNA。通过对分娩后的孕妇进行研究，发现胎儿DNA从母体血浆中清除的半衰期平均约为16．3分钟，肾脏可能在血浆清除中起作用。目前有几种可能的机制解释母体血浆中胎儿DNA的来源：

4、一种机制是，胎儿细胞硕士掌位论文检测孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断的初步研究中文摘要穿过胎盘屏障不断的漏出到母体血液循环中，同时被母体的免疫系统破坏，释放出DNA留在母体血浆中。另一种机制是，在胎儿的发育过程中，存在与发育相关的程序性死亡即凋亡，胎儿细胞的凋亡导致胎儿细胞不断裂解，将DNA释放到母体血浆中。凋亡的启动过程可自发启动或受到外界刺激引发凋亡的启动。分离母体血浆和血清中胎儿DNA的主要应用于以下几方面：l、遗传性疾病(性连锁遗传病、父系遗传病、唐氏综合征)2、R_h(D)血型不合溶血3、妊娠相关性疾病。综上所述，利用孕

5、妇血浆中的胎儿DNA进行产前诊断，为非创伤性产前诊断开辟了新的道路，有非常重要的临床意义。本研究的目的在于研究如何检测母体血浆中胎儿DNA，在孕早期做出产前胎儿性别诊断，并进一步探讨不同孕周的正常孕妇其血浆中胎儿DNA的量和浓度是如何变化的，为将来应用于非创性产前诊断作初步研究。本研究分两部分，第一部分用定性检测母体血浆中的胎儿DNA，证实母体血浆中存在胎儿DNA，可以在早孕期做出性别诊断。第二部分是用定量检测母体血浆中的胎儿DNA，通过SRY基因的检测，测定了不同孕周母体血浆中胎儿DNA及总DNA的量。第一部分：定性检测母体血

6、浆中的胎儿DNA2002年3月1日至2002年6月30日在本院孕早期人流、孕中期行羊膜腔穿刺术作产前诊断、足月待产的初产妇共38例，在术前或末临产前取肘前静脉血10ml，乙二胺四乙酸盐(ethylenedivinete胁ceficacid，EDTA)抗凝，经离心分离血浆。用苯酚、氯仿、异戊醇提取血浆中DNA后，选择Y染色体上的SRY基因，用巢式PCR扩增。用正常未孕女性和正常男性DNA分别作阴性对照和阳性对照。同时取人流术中吸出的绒毛作染色体培养、羊膜腔穿刺术抽取羊水作染色体培养以及出生胎儿的实际性别验证结果。早孕组20例，经巢

7、式PCR第1次扩增后，有7例出现351bp扩增带为阳性，13例未出现扩增带为阴性。这13例阴性样本进行第2次扩增后有6例出现254bp扩增带为阳性，7例未出现扩增带为阴性。根据两次扩增后结果判定怀有男性胎儿的孕妇为13例，怀有女性月fiJL的孕妇为7例。经绒毛染色体验证，13例判定怀有男性胎儿的孕妇中有12例绒毛染色体为46，xy，l例为46，xx；7例判定怀有女性胎儿的孕妇的绒毛染色体全部为46，XX，第1次扩增的阳性率为58．33％，无假阳性；第2次扩增的阳性率为100％，假阳性1例，阴性率为87．5％。中孕组6例，经巢式P

8、CR第1次扩增后，有3例出现35lbp扩增带为阳性，3例未出现扩增带为阴性。这3例阴性样本进行第2次扩增后有1例出现254bp扩增带为阳性，一2一司E士掌位论文检测孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断的初步研究中文摘要2例未出现扩增带为阴性。根据两次扩增后结果判定怀有