应用鼠疫菌全基因组芯片研究黄连抑菌机制的方法

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1、应用鼠疫菌全基因组芯片研究黄连抑菌机制的方法国内外研究现状：李书宝.中国鼠疫监测现状及疫情态势分析俞东征.我国鼠疫形势与鼠疫控制策略沈尔礼,张苇,高崇华,等.关于美国、秘鲁鼠疫防治工作的考察报告[J].HoltRD,DobsonAP,BegonM,etal.Parasiteestablishmentinhostcommunities[J].EcologyLetters,2003,6(9):8372842.PowerAG,MitchellCE.Pathogenspilloverindiseaseepidemics[J].AmericanNaturalist,2004,164Suppl

2、:S79288.目的:建立一种应用鼠疫耶尔森菌全基因组芯片研究黄连对鼠疫耶尔森菌抑制作用分子机制的方法。方法:应用液体稀释法测定黄连对鼠疫耶尔森菌的最小抑菌浓度(MIC)；鼠疫耶尔森菌全基因组芯片包含4005条鼠疫耶尔森菌基因。基因芯片表达谱实验中黄连作用鼠疫耶尔森菌的浓度为10×MIC，作用时间为30min；提取并纯化鼠疫耶尔森菌总RNA；逆转录合成cDNA；Cy3、Cy5染料标记后，与鼠疫耶尔森菌全基因组芯片杂交；通过芯片扫描仪获得表达谱分析结果。应用SAM软件处理结果，应用SAM软件处理结果。结论：应用鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片可以进行黄连抑制鼠疫耶尔森菌的分子作用机制研究立

3、项依据：鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)可以引起烈性传染病一鼠疫鼠疫，菌对常规的抗生素敏感，链霉素、氯霉素及四环素是鼠疫菌治疗的首选药物。抗生素的有效使用很好地控制了鼠疫的发生、流行以及蔓延。链霉素耐药株的出现使得鼠疫菌治疗药物研究变得尤为迫切。不断探索新的治疗药物是摆在每一位鼠疫防治工作者面前的光荣使命。前期的研究结果表明，在传统中药中黄连对鼠疫菌有较强的抑菌作用。为了继续深入探讨黄连抑制鼠疫菌的作用机制，探索黄连应用于鼠疫预防与治疗的可能性，通过应用鼠疫菌全基因组芯片建立研究黄连抑制鼠疫菌分子机制的方法。哈尔滨1910年特大鼠疫1、材料与方法1、1实验材料鼠疫菌201菌株为布氏田鼠疫

4、源地菌株，该菌株对人体无感染性，对小鼠具有高度毒力；分离自锡林郭勒高原布氏田鼠鼠疫疫源地(军事医学科学院微生物流行病研究所提供)。鼠疫菌全基因组基因芯片；由军事医学科学院微生物流行病研究所提供；扫描仪；为ScanArray4100(AxonInstruments，Inc)处理软件；为GenePixPro4．1(AxonInstruments，Inc。)黄连提取物：购自西安中鑫生物技术有限公司。1．2黄连作用鼠疫菌最小抑菌浓度(MIC)的测定黄连作用于鼠疫菌的MIC测定采用液体稀释法进行。准备系列含有1mlTMH液体培养基的试管，将黄连配制成相应浓度后加入含有培养基的试管中，以2倍比稀释

5、法逐管稀释黄连，最终各管黄连的浓度分别为0．1、0．05、0．025、0．0125、0．00625g／ml,在每个试管中加入1．5X10^8CFU／ml的细菌10ul,试验设空白及重复对照,28℃培养24h后，分别转种普通琼脂平板培养基，观察细菌在平板培养基的生长现象，无细菌生长的试管浓度为黄连作用鼠疫菌的MIC。1．3鼠疫菌基因芯片表达谱实验1．3．1实验分组选择黄连作用鼠疫菌组作为试验组，等量生理盐水相同条件作为对照组，进行基因芯片表达谱试验。黄连作用鼠疫菌的作用浓度为10×MIC。作用时间为30min。实验分组应用系列重复设置，包括2个生物重复，以及2个技术重复。对不同分组采用不

6、同荧光素交换标记。1．3．2鼠疫菌RNA提取应用细菌RNA保护剂(QiagenInc)分别对实验组与对照组细菌进行保护，保证细菌mRNA停留在进行保护的时刻。分别应用MasterPureTMRNA提取试剂盒(EpicentreInc)进行实验组与对照组鼠疫菌的总RNA提取，提取RNA后通过分光光度计与凝胶电泳鉴定提取RNA的质与量。1．3．3探针标记采用FindGDPs软件针对芯片上所有基因(4005个)为靶标设计全基因组特异引物(GDPs)，同时应用N6随机引物，将二者等量混合用于总RNA的逆转录。将获得的cDNA用QIAquickPCRPurificationKit(QiagenI

7、nc)试剂盒纯化，氨基标记cDNA的荧光素标记，应用Cy3与Cy5分别标记实验组与对照组的cDNA，标记完成后应用QIAquickPCR纯化试剂盒(QiagenInc)进行纯化。1．3．4芯片杂交与扫描杂交探针分别置于95℃变性5min，然后立即将探针加在芯片上，盖玻片封片置于杂交炉内42℃杂交16h。然后依次以2×SSC+O．2％SDS溶液、0．1％SSC+0．2％SDS溶液及0．1％SSC溶液各洗涤2min，电吹风吹干。用ScanArray