多头带绦虫脑多头蚴cDNA表达文库的构建及初步分析

《多头带绦虫脑多头蚴cDNA表达文库的构建及初步分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第18卷第3期寄生虫与医学昆虫学报Vo1．18．No．320i1年9月ActaParasito1．Med．Entomo1．SinSep．，2011doi：10．3969／j．issn．1005-05O7．2011．03．003多头带绦虫脑多头蚴cDNA表达文库的构建及初步分析术李文卉王建魁’盖文燕姚菊霞曲自刚贾万忠罗建勋RaduBlaga付宝权(1．甘肃农业大学动物医学院，兰州730070；2．中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部兽医公共卫生重点开放实验室，甘肃省动物寄生虫病重点实验室，兰州730046；3．兰卅f市七里

2、河区动物疫病预防控制中心，兰州730050；4．UniversityofAgriculturalSciencesandVeterinaryMedicine，Cluj-Napoca400372，Romania)摘要从甘肃景泰羊源脑多头蚴原头节提取总RNA，以Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA，利用LambdaZAPIIXR文库构建试剂盒构建了脑多头蚴cDNA表达文库。从构建的原始文库随机挑选单个噬菌斑进行PCR，确定文库重组率和插入外源基因片段大小，鉴定文库质量。结果表明脑多头蚴cDNA表达文库的原始库容量为1．0X10。pfu，扩增后文库滴度为1．6

3、X10pfu／mL。随机挑选的165个噬菌斑克隆中，0．25kb以上的克隆155个，重组率为93．9％，对其中0．5kb以上的115个克隆测序共获得104个表达序列标签(EST)，分析后得到96个单一EST序列(UniqueEST)，其中2O个EST与绦虫基因有同源性，38个EST与吸虫基因有同源性，4个EST与线虫基因有同源性，17个EST与其他物种有同源性，其余l7个EST没有同源基因。这些EST编码的氨基酸序列有多头带绦虫六钩蚴Tml6抗原、猪带绦虫副肌球蛋白、猪带绦虫免疫原蛋白Ts76等绦虫抗原的同源蛋白以及烯醇化酶等一些酶类、热休克蛋白、肌动蛋

4、白、核糖体蛋白等同源蛋白。关键词多头带绦虫；脑多头蚴；cDNA表达文库；表达序列标签脑多头蚴病俗称脑包虫病，是由多头带绦虫(Edwardseta1．，1982；Verstereta1．，1982；张Coenuruscerebralis的幼虫脑多头蚴寄生于牛、羊文宝等，1991；窦兰清等，1996，1997)，但是等中间宿主的大脑、脊髓等中枢神经系统而引起难于大量生产。随着分子生物学技术的发展及其的一种严重致死性人兽共患寄生虫病。该病不仅在寄生虫学研究中的应用，带科绦虫的许多抗原给畜牧业生产造成严重的经济损失，而且威胁着性基因已经被成功克隆，国内外学者根据

5、其他带人类健康。目前已经报道的应用于脑多头蚴病的科绦虫同源基因设计引物从多头带绦虫幼虫克隆免疫学诊断方法主要有间接血凝试验(IHA)、并表达了多头带绦虫45m、Tml6及Tml8基因，酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点免疫金渗滤其表达的重组蛋白均具有免疫保护性(由弘等，试验、斑点免疫吸附试验等(Daoudeta1．，2008；张壮志等，2009；Gaucieta1．，2008；1982；张西臣等，1986；Doganayeta1．，1999；Varcasiaeta1．，2009)。为了获得更多多头带绦王春仁等，2001)，但是由于所用的诊断抗原主虫抗原

6、性基因，本研究通过构建多头带绦虫脑多要是原头节和囊液抗原，这些天然抗原常与其他头蚴cDNA表达文库并进行初步分析，为进一步绦虫蚴病发生交叉反应而出现假阳性，限制了在筛选鉴定抗原性基因以及脑多头蚴病的诊断和预生产实践中的应用。多头带绦虫虫体抗原和排泄防研究奠定基础。分泌抗原用于免疫预防具有一定的效果收稿日期：2011-o2_21基金项目：国家“十一五”科技支撑计划项目(2007BAD40B04)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(BRF080303)；中国．罗马尼亚政府间科技合作项目(39-18)％通讯作者：E-mail：fubaoquan@163．

7、tom·139·寄生虫与医学昆虫学报第18卷第3期NZY平板，于37oI=培养6～8h。计数平板上噬1材料与方法斑数目并计算cDNA文库的原始库容量。1．7文库重组率测定1．1虫体样品通过PCR扩增单个噬菌斑检测插入外源收集甘肃省景泰县某羊场自然感染脑多头蚴cDNA片段的大小，计算文库重组率。随机挑取的绵羊，开颅腔摘取完整的脑多头蚴包囊，分离的单个噬菌斑分别置于200IxLSM缓冲液中，混原头节，一70℃保存备用。匀后4oC过夜。以此为模板，以T3和T7引物为1．2菌株上下游引物，进行PCR反应。反应条件为94℃大肠埃希氏菌E．coliXL1一Blue、

8、SOLR宿主预变性5min；94℃变性1rain，55℃退火1rain，菌、Ex