基于还原型氧化石墨烯荧光探针的核糖核酸酶检测分析

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1、学校代号10532学号S152201635分类号密级硕士学位论文基于还原型氧化石墨烯荧光探针的核糖核酸酶检测分析学位申请人姓名赵传培养单位生物学院导师姓名及职称刘斌副教授学科专业生物医学工程研究方向生化分析与分子诊断论文提交日期2018年5月22日学校代号：10532学号：S152201635密级：湖南大学硕士学位论文基于还原型氧化石墨烯荧光探针的核糖核酸酶检测分析学位申请人姓名：赵传培养单位：生物学院导师姓名及职称：刘斌副教授学科专业：生物医学工程论文提交日期：2018年5月22日论文答辩日期：2018年5月27日答辩委员会主席：陈良碧教授Detectionan

2、dAnalysisofNucleaseBasedonReducedGrapheneOxideQuenchedHairpinProbebyZhaoChuanB.E.(HengyangNormalUniversity)2015AthesissubmittedinpartialsatisfactionoftherequirementsfortheDegreeofMasterofScienceinBiomedicalEngineeringintheGraduateSchoolofHunanUniversitySupervisorAssociateProfessorLIUB

3、inMay,2018湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索

4、，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1．保密□，在年解密后适用本授权书。2．不保密□。(请在以上相应方框内打“√”)作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日I硕士学位论文摘要核糖核酸酶A（RNaseA）是一种广泛应用于酶学、生物化学、结构生物学等领域研究的工具酶，同时，这种具有有效杀伤肿瘤细胞和抑制HIV-1病毒复制能力的核酸酶可直接作为多种疾病的治疗药物；核糖核酸酶H（RNaseH）是一种特异性切割RNA/DNA双链中的核糖核苷酸的核酸内切酶，在调节免疫防御过程及维持真核生物基因组稳定方面具有重要意义。因此，开展两种相关性

5、核酸酶的活性监测不仅能对酶动力学进行分析而且能对酶与疾病之间的关系进行揭示。本论文基于还原型氧化石墨烯（rGO）尺寸小、分散性好、猝灭能力强这些优点，开展了简单、特异、灵敏的核糖核酸酶检测体系构建及其应用研究。主要内容如下：1.基于rGO荧光纳米探针的RNaseA酶活性分析方法建立和应用。首先，我们基于rGO和荧光探针构建了一个RNaseA活性检测平台。结果表明：该体系的最适还原型氧化石墨烯浓度为8µg/mL，最适反应温度与时间分别为37℃和35min。体系中RNaseA活性的检测下限为0.05pg/μL。为了验证该方法在实际中的应用性，我们利用该方法考察了不同价

6、态的重金属离子对RNaseA活性影响。结果表明：重金属离子Ba2+、Co2+、Pb2+、As3+、Cu2+对RNaseA活性的抑制效果均成浓度依赖性且其IC50分别为93.7μM(Ba2+),90.9μM(Co2+),110.6μM(Pb2+),171.5μM(As3+)and165.1μM(Cu2+)。之后，结合体内外实验考察药用植物天然提取成分与RNaseA之间的相互关系进行研究，发现一定浓度范围内，所有的小分子药物呈浓度依赖性激活RNaseA活性。细胞内实验表明RNaseA活性水平在SMMC-7721细胞中是MCF-7细胞中的1.5倍；G-10和Chikus

7、etsusaponinV处理诱导MCF-7和BEL7404细胞中RNaseA活性升高，对SMMC-7721细胞中RNaseA活性影响不大。最后，我们将新方法用于正常人与HBV患者血清样品中RNaseA活性水平比较，结果表明HBV感染能导致血清中的RNaseA活性降低。以上结果表明：本章建立的新方法不仅能用于RNaseA活性监测和效应药物筛选体内外快速、高通量筛选，而且还能用于与RNaseA活性变化相关的疾病早期诊断。2.基于rGO-DNAzyme猝灭荧光探针构建荧光循环放大法检测RNaseH及其天然抑制剂筛选。首先，我们基于荧光探针、rGO和DNAzyme发展了一

8、个RNas