铜绿假单胞菌DNl基因组学及荧蒽诱导下的转录组学研究

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1、分类号:Q93学校代码：10697密级:公开学号：201520848硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION铜绿假单胞菌DN1基因组学及荧蒽诱导下的转录组学研究学科名称：微生物学作者：何春秋指导老师：马艳玲副教授西北大学学位评定委员会二〇一八年TheTranscriptomicInducedbyFluorantheneandGenomicAnalysisofPseudomonasaeruginosaDN1AthesissubmittedtoNorthwestUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeof

2、MasterinMicrobiologyByHeChunqiuSupervisor:MaYanlingAssociateProfessorJune2018摘要多环芳烃（polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs）是分布广、难降解的有机污染物，因疏水性强、毒性大、污染持久而受到越来越多的关注。荧蒽是4环的高分子量多环芳烃，在结构上与咔唑、二噁英等类似，是研究此类型多环芳烃的模式化合物。本研究以铜绿假单胞菌DN1(PseudomonasaeruginosaDN1)为出发菌株，综合运用基因组、转录组和基于色谱技术的代谢组分析等方法解析荧蒽降解的分子机制。首先采用Pac

3、BioRSII和IlluminaMiseq结合的双末端测序技术获悉P.aeruginosaDN1的全基因组序列信息：全基因组是由6,959,251个碱基对(bp)组成，包括一个6,641,902bp的环形染色体（G+C含量67.09%）及一个317,349bp的质粒（G+C含量57.01%）；注释到6,450个蛋白质编码基因；运用rRNAmmer、tRNAscan、Rfam从全基因组中获得64个tRNAs和12个rRNAs。同时，P.aeruginosaDN1的基因组中预测到了一百多种与PAHs降解相关的基因，其中25个双加氧酶基因中包含了5个环羟基双酶基因。生物信息学分析发现P.aeru

4、ginosaDN1部分PAHs降解相关的基因发生了转移或重排，OthoANI比较分析结果显示：P.aeruginosaDN1与同属的其他菌株亲缘关系较近，且与模式菌株PAO1具有较好的共线性。在全基因组测序及分析的基础上，对荧蒽胁迫条件的P.aeruginosaDN1进行了RNA-Seq测序及分析，探究以荧蒽为唯一碳源条件下参与荧蒽降解、调控及转运等相关基因的表达情况。结果显示：荧蒽胁迫条件下的转录组分析检测到差异表达的基因数目为3,522个，其中上调及下调的基因分别为1,919和1,603个。结合基因组数据分析，发现在碳代谢、芳香烃化合物降解及苯甲酸降解等途径中存在大量差异表达的基因，其

5、中荧蒽降解过程中关键酶基因catA、pcaG和pcaH均呈明显上调趋势。为进一步探究这些关键基因在荧蒽降解过程中的功能，利用同源重组技术对catA、pcaG和pcaH进行基因敲除。实验结果表明：突变菌株在荧蒽、原儿茶酸和儿茶酚为唯一碳源时生长情况受基因缺失的影响，而在葡萄糖中生长无明显差异；尤其是突变株ΔpcaG和ΔcatA在分别以原儿茶酸和儿茶酚为唯一碳源时生长更缓慢。同时，三株突变菌株对荧蒽降解能力均受到影响，以基因pcaG的缺失对荧蒽降解率的影响显著。DN1菌株在以50μg/mL荧蒽为唯一碳源的MSM培养基中摇瓶培养9天，荧蒽降解率可以达到84.47%；而同等条件下突变菌株ΔpcaG

6、降解率仅为64.3%。此外，pcaH与pcaG作为铜绿假单胞菌降解荧蒽I过程中的关键基因，二者同为原儿茶酸-3,4-双加氧酶的编码基因，但ΔpcaH菌株的荧蒽降解率为71.67%，略高于ΔpcaG菌株。由此推测，catA、pcaG、pcaH等关键基因的敲除对荧蒽降解具有明显的影响，但其缺失并不能完全抑制荧蒽降解。同时，利用GC/MS色谱分析检测到荧蒽降解的发酵液中不仅残留有未降解的荧蒽，同时还检测到了9-羟基芴、1-二羟苊酮、1,8-萘二甲酸酐及α/β-甲基萘和2,3-二甲基萘等物质。由此推测菌株DN1降解荧蒽可能起始于C-7,8位点的双加氧反应，但不排除该菌株通过C-1,2和/或C-2,

7、3双加氧途径降解，详细的降解途径还有待进一步研究。关键词：铜绿假单胞菌，荧蒽，基因组，转录组，代谢途径IIABSTRACTPolycyclicaromatichydrocarbons(PAHs)arewidelydistributedandpersistentorganicpollutantsintheenvironment,whicharewellpromisingduetotheirhydrophobic,persi