鸭疫里默氏杆菌pcr快速检测方法的建立

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1、弘笛科字UU．1l鸭疫里默氏杆菌PCR，I央速检测方法的建立郭远奎(荣成市崖头畜牧兽医站，山东264300)摘要：在鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白保守区设计了一对特异性引物，建立PCR方法，对5株已知血清型的鸭疫里默氏杆菌纯培养菌和6株，临床分离未定型的里默氏杆菌菌株以及病死鸭病料组织进行检测，结果表明不同样品都可扩增出592bp的特异目的条带，而对鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌的扩增结果均为阴性，说明该PCR法具有较好的特异性，可用于快速鉴定鸭疫里默氏杆菌，也适用于病料的直接检测。关键词：鸭疫里氏杆菌；聚合酶

2、链式反应；检测中图分类号：S858．32文献标识码：B文章编号：l673—1085(2O09)ll一00O6—03鸭疫里默氏杆菌病即鸭浆膜炎．是由鸭疫里默1．1材料氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起鸭的一种1．1．1供试菌株已知血清型鸭疫里默氏杆菌5急性或慢性传染病，发病率为10％～90％，病死率高株和鸭源大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌各两株由达80％[1l。给养鸭业造成了巨大的经济损失。目前山东省农业科学院家禽研究所提供，其他6株未定RA已成为危害我国养鸭业的主要细菌性传染病之型鸭疫里默

3、氏杆菌菌株从发病鸭场分离并鉴定。一吲。临床上鸭疫里默氏杆菌常与大肠杆菌、巴氏杆1．1．2主要试剂和培养基细菌基因组DNA提取菌及沙门氏菌混合感染．由于其临床症状和病理变试剂盒为百泰克公司产品，Taq酶及其缓冲液、化与上述细菌病很相似，难以鉴别进而不能有效防dNTP、DNAMarkerDl200O购自宝生物工程(大连)治。需建立快速诊断方法来区分。现在的鸭场在发有限公司，TSA(Tryptics0yAgar)为青岛海博公司现鸭群有病时，立即用药，这样的鸭场送检的病料常产品。分离不到细菌，为了进行RA的流行病学研究必须1．

4、2PCR扩增建立鉴定RA的分子方法本研究为解决以上问题ll2．1PcR引物根据已发表RA的外膜蛋白A建立了鸭疫里默氏杆菌的PcR检测方法(0mpA)基因序列，在其高度保守区设计了一对特异1材料与方法性弓I物：P1：5一GGAGCCAACTATICAGAC一3．收稿日期：2009一l0一l6P2：5一GACCTGGAACATrAGGACACT一3，扩增现阶段所分离鉴定出的H、H]、H、H、H及H等流感具有重要的公共卫生意义。AIV的生物学和遗多种亚型的禽流感病毒株也提示，谁也无法预料我传学特性决定了研究要不断面临新的挑战

5、，使得对们将面对何种生物学特点和致病力的禽流感病毒，禽流感的研究和控制己刻不容缓。必须用科学的方我们注定要不断面临新的挑战法来控制禽流感的流行。因此．新的更有效的疫苗由于禽流感是一种全球性的烈性传染病，可在研究势在必行。“高科技”的禽流感疫苗必须集防宿主中断发乍变异和基因重组，因此将是2l世病、防病毒隐藏、防病毒扩散于一身。理想的禽流感纪我养ll，I⋯最大的瘟疫性威胁禽流感可在疫苗必须同时具备诱导产生中和抗体和CTL反禽、猪和人r{，进f传播AIV不仅作为人流感的应。随着科技的进步和人们对生命的认识不断加最大琏4⋯J接

6、域人类健康，而且可作为人类深，有理由相信一种能改变流感病毒防治状况的新的靳t{j=⋯l¨受缃埘人类的威胁。因此．预防禽型疫苗的出现指日可待。口6，0，vcene片段长度为592bp，由北京博尚生物工程有限公司合成。1．2．2模板DNA的制备1．2．2．1基因组DNA模板的制备挑取TSA平板上单个菌落，接种于rrSA液体培养基，37℃快速摇振培养20h，离心取菌泥，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取各菌株的基因组DNA，作为PcR的模板。图l以基因组DNA为模板RA菌株的PCR扩增结果1．2．2．2病料中PCR模板的制备取

7、病死鸭的各种注：1—5为已知血清型的RA，6一ll为未知血清型组织约1mms，匀浆器研磨均匀．于加有5％的小牛血的RA，M为DNAMarker20o0。清和5Og，ml的庆大霉素的TsA液体培养基中增殖照菌未出现相应条带。见图2。4h后，吸取悬浊液于离心管用生理盐水洗涤1次．再按煮沸法提取模板DNA，用于PcR扩增。1．3PCR检测体系的建立以细菌的基因组DNA和病料提取液为模板，利用设计好的引物，进行PcR2O08IOOOO扩增。反应体系(501)：1Oxbuffer5l，2．5mmol，25OlOOlMgCl23肛

8、l，2．5mmol／ldNTP4l，20pmol／mlPI1l，20pmoP21l，DNATemplate1l，TaqDNAPoly—mer—ase0．5l，ddH2O34．5l。PCR反应程序为：图2PCR方法的特异性检测结果注：1～5为已知血清型的RA，6、7为鸭源大肠94℃5min；进入PCR循环94cC30s，54．3℃6