大孔-介孔分级孔材料固定化酶及其性能研究

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1、分类号：密级：UDC：编号：河北工业大学硕士学位论文大孔-介孔分级孔材料固定化酶及其性能研究论文作者：尹璐研学生类别：全日制学科门类：工学学科专业：生物化工指导教师：姜艳军职称：教授高静教授资助基金项目：国家自然科学基金（No.21276060,21276062,21106164,21576068）；天津自然科学基金（16JCYBJC19800）；河北省自然科学基金（B2015202082,B2016202027）。ThesisSubmittedtoHebeiUniversityofTechnologyforTheMasterDegreeofBiochemicalEngine

2、eringIMMOBILISATIONOFENZYMEONHIERARCHICALLYORDEREDMACROPOROUS/MESOPOROUSMATERIALANDITSCATALYTICAPPLICATIONByLuyanYinSupervisor:Prof.YanjunJiangProf.JingGaoMay2017ThisworkwassupportedbytheNationalNatureScienceFoundationofChina(Nos.21276060,21276062,21106164and21576068),theNaturalScienceFound

3、ationofTianjin(16JCYBJC19800),theNaturalScienceFoundationofHebeiProvince(B2015202082andB2016202027).摘要具有大孔-介孔的分级孔结构材料拥有周期有序的大孔及均一的介孔结构，拥有良好的传质性和较大的比表面积，这使得该类型材料在固定化酶领域有着十分重要的应用。本论文分别构建了具有大孔-介孔分级孔结构的氧化硅（3DOM/m-S））和氧化铝材料（3DOM/m-Al），并以其为载体进行酶的固定化，并利用固定化酶进行碳酸甘油酯的制备研究，具体研究内容如下：（1）大孔-介孔分级孔结构硅材料固定

4、化酶及动力学研究。以聚苯乙烯（PS）胶体晶体为硬模板，三嵌段共聚物（P123）为软模板制备分级孔结构硅材料（3DOM/m-S），同时选择南极假丝酵母脂肪酶（CALB）为模型酶，利用物理吸附法实现酶的固定化（CALB@3DOM/m-S）。通过对PS胶体晶体模板的表征可以看出，模板具有良好的均一性以及三维结构。将制备的3DOM/m-S进行表征可以看出，大孔孔径为450nm，介孔大小约为5.2nm，比表面积为245.6m2/g，孔体积为0.4690cm3/g。激光共聚焦（CLSM）显微镜图证实了脂肪酶的成功固定化。随后，研究了固定化酶CALB@3DOM/m-S催化月桂酸和辛醇酯化反

5、应的动力学。其中，CALB@3DOM/m-S催化的酯化反应在正己烷中活性最高。动力学研究表明，辛醇会对酶活产生抑制作用，该固定化酶催化酯化反应符合有底物抑制的Ping-PongBi-Bi反应机制。根据此动力学模型，通过实验数据计算出了该反应的动力学常数，其中，固定化酶对月桂酸和辛醇的米氏常数分别为179.8mM和163.8mM，辛醇的抑制常数为54.41mM。（2）大孔-介孔分级孔结构铝材料的制备及固定化酶性能研究。利用双模板结合挥发诱导自组装合成的方法，制备了大孔-介孔分级孔结构铝材料。通过SEM和TEM表征结果可知，该材料具有良好的三维有序大孔和有序介孔结构。利用共价结合

6、法将游离酶（南极假丝酵母脂肪酶、青霉素酰化酶、腈水合酶）固定于氨基化的载体上，CLSM表征结果证实酶已经成功固定到载体上。优化了固定化条件，得到三种酶固定的最适戊二醛浓度分别为1.2wt%、1.6wt%和0.8wt%；经0.5h的共价结合后，最适初始酶浓度为400mg/gsupport、90mg/gsupport和270mg/gsupport。稳定性研究表明，酶经固定化后，其热稳定性明显优于游离酶，且重复操作稳定性良好。（3）新型固定化脂肪酶催化合成碳酸甘油酯。以生物柴油工业中的副产物甘油为原料，通过与碳酸二甲酯转酯反应合成碳酸甘油酯，选择CALB@3DOM/m-S作为催化剂

7、，催化甘油和碳酸二甲酯的转酯反应的最适反应条件为：在无溶剂体系下，底物摩尔比DMC:甘油为10:1，酶用量为30g/L，分子筛用量为0.4g，最适温度为50℃，加I入10%（V/V）的表面活性剂曲通100，当反应时间为24h，碳酸甘油酯产量达到平衡。在此条件下，甘油的最大转化率达到93%，碳酸甘油酯（GC）产率达到89%，在重复使用6次之后，其催化合成GC的产率仍能达到60%，有效提高了酶的重复使用性。同时与商品化固定化脂肪酶Novozyme435进行了比较，发现CALB@3DOM/m-S在重复使用过程