土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数【课题目标】研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。【研究对象】土壤中能分解尿素的细菌【达到目的】（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O3、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放

2、线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照1、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。㈠.筛选菌株要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基方法：⑴抑制大多数微生物生长⑵造成有利

3、于该菌生长的环境，结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。3、培养基选择分解尿素的微生物的原理15.0g琼脂1.

4、0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO44、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素选择培养基1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点2.间接计数法（活菌计数法）（1）常用方法：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中

5、，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mＬ)，M代表稀释倍数。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（2）原理：稀释涂布平板法。注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在5

6、0个左右为最好。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。㈢.设置对照：设置对照的方法：空白对照：不给对照组任何处理因素。条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误。单一变量原则小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制

7、的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。二.实验的具体操作㈠.土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。㈡.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落

8、数在30～300之间、适于计数的平板[三]样品的稀释为什么分离不同