土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数课题2微生物的培养与应用一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O1、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，提供有利于目的菌株生长的条件。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA

2、大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。㈠.筛选菌株15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO42、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖唯一氮源：尿素选择培养基培养基的唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解利用尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，

3、所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。3、培养基选择分解尿素的微生物的原理选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。（1）将土壤中的固氮菌分离出来（2）将土壤中自养微生物分离出来举一反三（3）筛选出抗青霉素的微生物（4）筛选出耐高浓度食盐的微生物……1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积（1mm2）和高（0.1mm）的计数室，在1m

4、m2的面积里又被划分成25个（或16个）中格，每个中格进一步划分成16个（或者25个）小格，但计数室都是由400个小格组成。计数室②操作：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再将稀释的样品滴在计数板上，然后在显微镜下统计4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品中所含的细菌数。③计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数。1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能

5、区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：2.间接计数法（活菌计数法）（1）常用方法：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（2）原理：稀释涂布平板法。说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布

6、至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足

7、条件的是对照组，未满足条件的是实验组。㈢.设置对照：判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（牛肉膏蛋白胨固体培养基）与选择培养基接种后培养观察菌落数目。小结：对照组虽然不直接影响结果，但实验结论要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A

8、同学存在操作失误或培养基的配制有问题。二.实验的具体操作㈠.土壤取样从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。㈡.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同，一般，细菌>放线菌>真菌。目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。