同源异型盒转录因子DLX4对绒癌细胞凋亡及侵袭能力的影响

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1、复旦大学博士学位论文同源异型盒转录因子DLX4对绒癌细胞凋亡及侵袭能力的影响中文摘要绒毛膜癌(绒癌)是一种来源于胚胎滋养细胞的恶性肿瘤，恶变的滋养细胞失去绒毛结构而侵蚀子宫肌层或转移至其他器官，造成破坏，以致病人死亡，具有高度恶性。尽管对于绒癌的病因和发病机理有许多学说，但其确切的发病机制仍不清楚。同源异型盒基因DLX4是新近发现的转录因子。近年来的研究表明，它在多种肿瘤的发生发展中超重要作用。但其与绒癌发生的关系以及对绒癌细胞生物学行为影响的研究尚少。本课题从研究DLX4在各种绒癌细胞和正常胎盘组织中的表达入

2、手，利用RNA干扰(RNAi)技术抑制了绒癌细胞株JEG一3中DLX4的表达，并运用westernblot、RT—PCR、免疫组化、流式细胞检测、明胶酶谱、Matrigel体外侵袭实验、划痕实验等探讨它在绒癌细胞凋亡和侵袭过程中的作用。我们的实验结果提示DLX4在绒癌细胞中的异常表达是影响绒癌细胞凋亡和侵袭的重要因素之一。本课题共分三部分：(1)DLX4在绒癌细胞株中的表达；(2)DLX4RNA干扰诱导绒癌细胞的凋亡；(3)DLX4对绒癌细胞运动、侵袭能力的影响。第一部分DLX4在绒癌细胞株中的表达目的检测DL

3、X4在人绒癌细胞株和正常绒毛、胎盘组织中的表达，探讨它与绒癌的关系。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测人绒癌细胞株JAr及JEG一3细胞中DLX4mRNA的两种形式(isoforml和isoform2)的表达、Westernblot检测DLX4蛋白的表达，并与30例正常早期妊娠绒毛和8例晚期妊娠胎盘组织进行对照。结果(1)DLX4基因mRNA的两种形式在绒毛、胎盘组织、JAr及JEG一3复巨大学博上学位论文细胞中均有表达，而在JAr和JEG一3中的表达水平显著高于正常的胎盘、绒毛组织(均为p

4、01)；JAr、JEG一3细胞以及胎盘组织中isoform2的表达水平高于isoforml，而正常绒毛组织中isoforml的表达水平高于isoform2。(2)DLX4蛋白在JAr及JEG一3细胞中的表达水平高于正常的绒毛和胎盘组织中，且在JEG一3细胞中的表达水平高于JAr细胞。与RT—PCR的结果一致。结论DLX4的高表达可能与绒癌的发生有关；DLX4基因isoform2在绒癌的发生中可能较isoforml起更重要的作用。制。第二部分DLX4RNAi诱导绒癌细胞的凋亡目的探讨同源异型盒基因DLX4对绒癌细

5、胞凋亡的调节作用以及相关机方法选择高表达DLx4的绒癌细胞株JEG一3细胞作为研究对象。设计了两条DLX4特异性的siRNAs(S1和S2)和一条阴性对照DLX4scrambledSiRNA，并分别克隆入pRNA质粒载体，将重组子转入JEG一3细胞，用RNAi抑制了JEG一3细胞中DLX4的表达。半定量RT—PCR和Westernblot检测干扰效果，流式细胞仪和M30免疫组化染色评价特异性的抑制DLX4的表达对JEG-3细胞凋亡的影响。并检测了与凋亡密切相关的caspase-3、caspase一8以及Bax的

6、表达，初步探讨DLX4调节凋亡的机制。结果(1)两条DLX4siRNAs(s1和S2)均特异并有效地抑制了JEG一3细胞中DLX4的表达。同未转染组和转染pRNA-DLX4(scrambled)siRNA组相比，S1组在转染后24h一72h，DLX4mRNA的表达水平下降了25—88％(DI。X4isoforml，p

7、5—85％(DLX4isoform2，p

8、是通复旦大学博士学位论文过转录调节caspase一3和caspase一8的表达水平，激活一系列与凋亡有关的蛋白从而诱导JEG一3细胞的凋亡。第三部分DLX4对绒癌细胞运动、侵袭能力的影响日的探讨同源异型盒转录因子DLX4对绒癌细胞侵袭能力的调节作用。方法选择高表达DLX4的绒癌细胞株JEG一3细胞作为研究对象。利用第二部分中设计、合成的DLX4特异性的siRNA(S1)和DLX4scr