大熊猫犬冠状病毒的分离鉴定及S基因部分序列的测定和分析

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1、吉林农业大学硕士学位论文大熊猫犬冠状病毒的分离鉴定及S基因部分序列的测定和分析姓名：高凤山申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：胡桂学;夏咸柱20030601吉林农业大学硕士学位论文大熊猫走冠状病毒的分离鉴定厦S基因部舟序列的测定和分析摘要本研究从某动物园两只死亡大熊猫的肝、脾等脏器分离病毒，经MDCK细胞适应培养，获得一株病毒(命名为DXMV)，在该细胞上可形成有规律的病变。电镜负染观察，病毒粒子有冠状纤突：超薄切片观察，于胞浆内形成病毒包涵体。理化学研完表明，该病毒为RNA病毒，对氯仿、乙醚敏感；胰酶试验中，经37℃、1小时处理的病毒，仍然

2、能够在猫源细胞FCWF细胞上生长，并且毒力基本保持不变；耐酸性试验中，病毒分剐在pH5．0和pH3．o经3’℃作用2小时，毒力仅下降一个滴度；耐热性试验中，该病毒在恒定温度50℃，设定不同时间．从5分钟到150分钟，毒力均有不同程度下降，其中，50℃作用30分钟，病毒平均滴度下降2个单位：50℃，60分钟，CPE消失；恒定时间1小时，设定不同温度(50℃一60℃一70℃一80℃)，病毒在细胞上完全丧失增殖能力，CPE消失。生物学试验，利用实验室现有条件，选择不同的细胞系对该病毒进行培养，发现该病毒时猫源细胞FCWF最敏感：MDCK细胞次之；F81细胞

3、经多次传代，亦可出现CPE：而Vero细胞则不敏感。血凝试验表明，该病毒对猪、鸡，,k／J琢-鼠的红细胞均无血凝性。利用夫冠状病毒特异性血清经中和试验，初步可确定该分离病毒属于犬冠状病毒。分子生物学研究方面，先选用多聚酶区冠状病毒通用引物2Bp和4Bm，该引物含有多个兼并碱基，能扩增出11种冠状病毒：合成该引物，选择大熊猫肝组织原代病料和该分离病毒的各代细胞培养物，均成功地扩增出了目的片段，而未接毒FCWF对照细胞PCR扩增阴性；在此基础上，又选择犬冠状病毒特异性引物，该引物是一种套式(Nested)引物，位于S基因201—1286bp之间，包括两对

4、引物，CCVFI—CCVRI；CCVF2一CCVR2。第一对引物为外层引物，可扩增出1086bp的核酸片段；第二对引物为内层引物，可扩增出515bp的核酸片段。该引物以K378为参考株，含有多个兼并碱基，可扩增出包括K378、Insavc一1、CCVI一71、NVSL吉林农业大学硕士学位论文大熊猫走冠状病毒的分离鉴定及s基因部分序列的测定和丹析等多种犬冠状病毒。合成该套式引物，选择大熊猫原代病料和病毒各代细胞培养物，经套式(Nested)RT—PCR扩增，可得到一与设计值515bp相符的DNA片段，经BST—xJ(590，1110)酶切鉴定，证明该扩

5、增片断为特异性片段；回收大熊猫肝组织原代病料和细胞培养物第2、3、29代的CCVF2一CCVR2扩增片段，纯化，送生物公司测序。序列用生物软件编辑，并比较各代次病毒基因序列，证明各代次病毒为同一种病毒；回收大熊猫第3代细胞培养物CCVFI—CCVRI1086bp的PCR扩增片段，纯化，测序，经生物软件编辑，得到一段1047bp的序列．然后与Genbank上发表的各CCV毒株的核苷酸序列进行分析比较，得到该分离病毒与NVSL、CCVI一71、x378、Insavc一1的同源性分别达到了100％，99．5％，98．3％，88．5％：推导的氨基酸序列同源性

6、分别达到了100％，98．9％，96．6％，90．5％。本研究首次从大熊猫体内分离和鉴定了CCV，揭示大熊猫亦可感染CCV，从而为大熊猫的疾病防治工作提供了必要的信息和资料，同时也丰富了冠状病毒尤其是犬冠状病毒的研究内容。关键词：大熊猫；分离和鉴定；犬冠状病毒II吉林农业大学硕士学位论文太熊猎犬冠状病毒的舟离鉴定及s基固部分序列的测定和分析ABSTRACTInthisstudy，anunknownvirusdesignatedDXMVwasisolatedfromIiversandspleensoftwodiedpandasinaZOOusingMD

7、CKcellline．TheviruscouldmultiflyontheMDCKcells，andinduceregularcytopathiceffect(CPE)．Observedbynegativestainingelectronmicroscope，theviruscouldbeseenwithcoroniformspike．Intheultrathinsections，theviruseswerefoundtomultiplyandinduceinclusionbodyforminginthecytoplasm．Physicochemic

8、alassaysshowedthatthisviurswasakindofRNAvirus，andsensi