《广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
分类号蔓墨丝：皓UDC——————硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒0RF2的扩增和抗原性分析肖爱欢学科专业亟随兽医堂指导教师黄鱼坚数援赵武巫究员论文答辩日期2Q!Q：Q鱼：Q垒学位授予日期2Q!Q：Q鱼答辩委员会主席睦童趑婴究员论文评阅人扬威婴究虽郄到主推亡研究虽 lIIIII／111111111111111]1111IlUllIIIlY1737720广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。论文作者签名：勿肋年6月勿日，学位论文使用授权说明本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：，动即时发布口解密后发布(保密论文需注明，并在解密后遵守此规定)论文作一：彩么导师繇荔绎望2,汐／o车多月加日 广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析摘要戊型肝炎(HepatitisE，HE)是由戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEY)引起的消化道病毒性肝炎。大量的报道已经证实，HE在国内外均非常的盛行，人和多种动物对HEV均易感。广西为我国养猪大省，但对于猪群HE的调查及HEV的抗原性研究仍处于起步阶段，因此弄清广西猪戊型肝炎的流行状况、猪源HEV与人源HEV在基因水平上的差异、HEV抗原表位的分布及抗原性基因的特征，对于戊型肝炎的防治、疫苗的研发都具有重大的意义。研究一，本研究通过RT-nested．PCR的方法对2009年07月至2010年03月从广西6个市县13个不同规模猪场采集的135份新鲜猪粪进行检测。结果显示135样品中有38份为HEVRNA阳性，阳性率为28．1％。在调查的13个猪场中，仅有一个猪场未检测到HEVRNA，猪场阳性率为92．3％。各猪场样品检出率在0．44．4％之间，13各猪场中有8个猪场感染率处于30．45％之间。对13个猪场中各种年龄样品均能采集到的6个猪场的猪群进行感染率调查，67份不同月龄的样品中，O．30日龄HEVRNA阳性率为O％；31．60日龄阳性率为7．7％；61．90日龄HEVRNA阳性率为40％；91．120日龄HEVRNA阳性率最高，为58．8％；当猪群年龄超过120日龄后HEVRNA阳性 率逐渐降低，阳性率为30．8％。结果显示2．4月龄为猪群的感染高峰期，32份样品中有16份样品为HEVRNA阳性，阳性率为50％。随机对24份阳性样品进行克隆，去除4份同源性为100％的分离株后得到20株同源性不一致的毒株。20株分离株间核苷酸同源性为91．2．99．7％。与基因型I型、II型、III型、Ⅳ型及禽HEV参考序列核苷酸同源性分别为：78．6．83．4％，75．9．77．9％，75．3．81．4％，83．4．97．7％，55．6．58．9％。20株分离株间氨基酸同源性为97．7．100％，其中13株氨基酸同源性为100％。与基因型I型、II型、ⅡI型、Ⅳ型及禽HEV参考株氨基酸同源性分别为：92．4．95．5％，93．1—93．9％，94．7．97％，97．7．100％，55．6．56．5％。通过用MEGA4．1软件Neighbor-Joining中的P一距离法对20株分离株及各基因型参考株进行进化树构建与分析，结果显示所有的分离株均属于基因型Ⅳ型。在所有Ⅳ型序列中又可以分为6个亚型，本研究所有的分离株都分布在亚型b中。研究二，参考中国T1株序列设计巢式引物，从新鲜猪粪中扩增HEV部分基因片段，长为1725bp，位于HEVORF2205—1929bp之间，命名为HEVORF2．A。其后根据HEVORF2．A序列设计三对引物分别扩增HEVORF2．A三段连续的基因片段，命名为HEVORF2一B1、HEVORF2一B2、HEVORF2．B3，分别位于HEVORF2-A1-576bp，577—1149bp，1150-1725bp之间。将四段扩增的基因片段分别与表达载体PET32a(+)连接，转入BL21(DE3)plysS感受态细胞，IPTG进行蛋白诱导。经1mmol／L的IPTG在37。C诱导6小时后，除PET32a—A在82．6kd处有微量融合蛋白表达外，PET32a．B1，PET32a．B2，PET32a．B3分别在41．3kd、41．5kd、41．8kd处有Ⅱ 高水平的融合蛋白表达。用自然感染猪血清和万泰HEVELISA诊断试剂盒阳性对照血清进行western。blot检测，三个短的融合蛋白均能检测到明显的条带，表明本研究所构建的三个表达载体具有良好的抗原性。关键词：广西猪戊型肝炎病毒扩增进化树ORF2原核表达抗原性III MoLECULAREPIDEMIoLoGYOFHEPA汀ITISEINGUANGXIPIGANDAMPLIFICATEHEPATITISEVIRUSORF2ANDANTIGENICANALYSISABSTRACTHepatitisE(HE)isagastrointestinalviralhepatitiscausedbyHepatitisEvirus(HEv)．AlargenumberofreportshaveconfirmedthatHEisverypopularbothatdomesticandabroad，humanandavarietyofanimalsaresusceptibletoHEV．Guangxiisalargeareaofpigproduction，buttheepidemiologicalinvestigationinpigsaboutHEandthestu#ofantigenicofHEVstillisatinitialstage．Therefore，epidemiologicalinvestigationofswineHEinGuangxiandthedifferencesbetweenswineHEVandhumanHEVingenelevel，determinationthedistributionofHEYepitopeandthecharacteristicsofantigengeneswillbeagreatsignificanceforpreventingHEandreserchingvaccine．Infirststudy,weusedRT-nested—PCRmethodtotest135freshpigfecalsamplesfrom13farmsthatlocatedin6citiesorcountiesinGuangxifromJuly2009toMarch2010．Theresultsshowedthatinthe135samples，38werepositivetoHEVRNAandpositiveratewas28．1％．Among13pigfarms，Only1IV pigfarmcouldnotdetectedHEVRNAandPigfarmpositiveratewas92．3％．ThedetectionrateofthefarmssampleswasO％to44．4％and8of13farmsinfectionratewas30％to45％．Weinvestigatedinfectionratein6of13farmsthatallagesgroupsamplecouldcollect．In67samplesfromdifferentmonths，HEVRNApositiverateWasO％intheageof0—30days；Positiveratewas7．7％intheageof31-60days；Positiveratewas40％intheageof61--90days；Theageof91--120dayswashighestHEVRNApositiverate，58．8％；Whenthepigsovertheageof120days，theHEVRNApositiveratedecreasedandpositiveratewas30．8％．Theresultsshowedthattheageof2-4monthswasthepeakofinfectioninpigsand16of32sampleswerepositivefortheHEVRNAandpositiveratewas50％．24positivesampleswereclonedrandomly．Afterremoval4100％homologousisolates，wegot20isolatesthatwerehomologyinconsistent．Nucleotidehomologywere91．2—99．7％amongthe20isolates．ComparisednucleotidesequencewithgenotypeI，II，HI，IVandavianHEY,theresultshowedthatnucleotidehomologywere78．6—83．4％，75．9—77．9％，75．3—81．4％，83．4—97．7％，55．6—58．9％respectively．Therewas97．7—100％homologyofaminoacidinthe20isolates．Among20isolates，13isolatesshared100％homologyinaminoacid．CompariseaminoacidsequencewithGenotypeI，II，III，IVandavianHEY,theresultshowedthataminoacidhomologywas92．4-95．5％，93．1—93．9％，94．7—97％，97．7—100％，55．6—56．5％。Constructionofthephylogenetictreebasedon20isolatesandreferencedV sequencefromfivegenotypeswithP-distanceofneighborjoiningofMega4．1software．TheresultsshowedthatallisolatesbelongedtogenotypeIV．AllgenotypeIVsequencescouldbedividedintosixsubtypesand20isolatesdistributedinsubtypeb．Insecondstudy，accordingtotheofChinaT1strain，twopairofprimersweredesignedandthepartialgenefragmentofhepatitisEvirus，length1725bp，locatedin205bpto1929bpofHEVORF2，namedasHEVORF2-A，wasamplified．Subsequently,accordingtotheofHEVORF2一A，threepairsofprimersweredesignedtoamplifythreecontinuousgenefragmentsinHEVORF2一A，namedasHEVORF2一B1，HEVORF2一B2，HEVORF2-B3，correspondedwiththe1-576bp，577—1149bp，1150-1725bpinHEVORF2-Arespectively．ThefouramplifiedgenefragmentswereconnectedtotheexpressionvectorpET32a(+)，transformedintocompetentcellsBL21(DE3)plysSandinducedwithIPTG．Afterinducedin37"Cfor6hourswithlmmol／LIPTG，thefusionproteinswerehighlyexpressedin41．3kd，41．5kd，41．8kdofpET32a—B1，pET32a—B2，pET32a—B3respectively,butlowlevelwasexpressedin86．2kdofpET32a-A．TheresultsofWestern—blotindicatedthatthethreeshortfusionproteinscouldberecognizedbyPositiveserafromthenaturalinfectedpigsandnormalsera．Thisstudyimpliedthatthethreeconstructedexpressionvectorshavegoodantigenicity．KEYWORDS：Guangxi；swinehepatitisEvirus；amplification；phylogeneticVI tree；ORF2；Prokaryoticexpression；antigenicityVII 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．I英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．Ⅳ目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．Ⅷ第一部分前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．HEV病原学研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1戊型肝炎病毒史⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。11．2分类和分类更新⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．3病原形态⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．4病毒的培养特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．32．分子生物学研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～32．1病毒的基因组特征及功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一32．2病毒的三维结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．52．3基因型、亚型、分离株及分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．63．传播方式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。83．1潜伏期⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．83．2HE在人群罩的传播途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。83．3种问交叉感染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯104．临床表现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯114．1在疾病流行区域的临床表现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l4．2在非流行区域的临床表现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯124．3慢性肝炎和器官移植⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯124．4动物HE临床表现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．135．HE流行病学调查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．135．1HE在国外的流行情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。135．2HE在国内的流行情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．155．3HE在广西的流行情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．176．{：参断⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯176．1抗HEVIgG检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．186．2抗HEVIgM检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．186．3抗HEVIgA检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．186．4HEV抗原诊断方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯196．5HEVRNA检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．197．预防⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯207．1水、食品和环境安全⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯207．2免疫预防⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯208．疫苗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯208．1HEV疫苗的免疫基础⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l8．2重组蛋白疫苗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯218．3DNA疫苗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．248．4临床试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24VIⅡ 8．5疫苗研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯259．研究的目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25第二部分试验研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27一广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及基因型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．271．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯271．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一271．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一282．结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯342．1广西猪戊型肝炎流行情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯342．2猪群不同年龄感染率调查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯352．320株分离株之间及与参考株同源性比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯362．4遗传进化树分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42二猪戊型肝炎病毒ORF2的扩增及抗原性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯451．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯451．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．451．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一462．结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．502．1HEVORF2．A片段的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．502．2HEVORF2．A与参考序列同源性比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．502．3HEVORF2．A三段连续基因片段的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．502．4重组表达质粒的构建和鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l2．5表达质粒序列测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯522．6SDS．PAGE电泳分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．522．7Western—blot抗原性检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一523．讨论与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53三结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯57附录：英文缩写对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯74致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．75发表文章⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯76IX 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析第一部分前言戊型肝炎病毒(HEV)是一种能引起多种动物感染的无囊膜RNA病毒，该病毒是肝炎病毒科肝炎病毒属的成员之一【l】。病毒基因全长约7．2kb，由3个阅读框构成，ORFl编码非结构蛋白，如氨基酸转移酶、解旋酶和RNA依赖RNA聚合酶；ORF2编码病毒的衣壳蛋白；ORF3编码联合磷酸蛋白的细胞骨架口，31。戊型肝炎病毒在世界各地均有分布，主要是通过粪口途径的方式感染。HEV主要感染青年人，死亡率为1％一2％，但在怀孕妇女死亡率高达25％【4】。在发展中国家特别是生活条件低下的亚洲、非洲、拉丁美洲国家，HE是一个严重的公共卫生问题。除此之外，在许多发达国家，包括美国、欧洲等也有散发性病例的报道。令人惊奇的是在这些发达国家人群很少与动物接触，但仍然出现了较高的抗HEV抗体阳性率【5】，暗示了HEV可能存在着其他的感染途径。HE为动物传染病，它能在多种动物间交叉感染。以往研究使用HEVU．S株和印度株试验攻毒非灵长类动物【6】，能引起该种动物感染；另外，人源或猪源HEV试验感染SPF猪，也能引起SPF猪感染【71。HE无论对养殖业还是对人类的健康与生命安全都造成了很大的威胁。目前，HE已被世界卫生组织(WHO)认为是发展中国家一个重要的公共卫生问题。1．HEV病原学研究1．1戊型肝炎病毒史最近发现戊型肝炎是由戊型肝炎病毒感染引起。5种公认的肝炎病毒分别是，甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEVoHE最早报道是在1955年至U1956年在印度新德里通过水传播引起的大流行【引。这次大流行最初被认为是由也W引起，但是对这次大爆发收集的血清及1978年至1J1979年在印度克什米尔爆发的流行人群中采集的血清进行检测，结果未能检测到HAV和HBV特征性的标记【9】，从而暗示了存在一种引起肝炎的新病原，暂时命名为非A非B的肠道传播病毒。此后不久，通过免疫电镜对摄入患有非A非B肝炎病人粪便志愿者的粪便样品进行检测，确定了这种类病毒颗粒‘10】。基于该病毒肠道传播途径和倾向与引起流行的特点，将该病毒命名为戊型肝炎病毒。1990年HEV的基因被克隆，不久后全基因序列被测定12]。HE在卫生条件不良的区域流行，包括亚洲的大部分地区、非洲、地 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析中海、墨西哥、南非nu(图1．1)。在流行国家，HE的发生与中等到大规模的水源污染有关。在发达国家(HEt}流行国家)，HE的发生几乎是由于患者至IJHEV流行区域旅行引起。然而，在过去的十年中，发达国家本地HEV感染不断增加及发现了HEV动物宿主的证据，这种发现引起了全球重新对该病的兴趣。19世纪和20世纪早期，在欧洲发生了几次肝炎的爆发。当时在这些地区卫生条件低下。这几次爆发中肝炎流行特征与HE的特征相似，这就提示了HE在目前非流行的区域在以往是非常流行的。图l-lHE流行区域(阴影部分)Fig．1-1．HEpopulararea(shaded)1．2分类和分类更新戊型肝炎病毒的命名有些难以确定。HEV最初被划分为杯状病毒科。但是，由于HEV与杯状病毒基因序列同源性不是很高，紧接着HEV就从杯状病毒科分离出来，被确定为肝炎病毒科肝炎病毒属的唯一成员。然而，最近又从多种动物确定了新的HEV毒株，HEV的分类可能会被重新修改。HEV在哺乳动物分为四个主要的基因型【121：基因型I型(缅甸及亚洲毒株)，基因型lI型(单一的墨西哥株和一些非洲株)，基因型III型(发达国家人散发性HEV株和来自猪、鹿、猫鼬的动物源毒株)，基因型Ⅳ型(亚洲散发性人源HEV毒株和猪源HEV毒株)。最近，在中国农场饲养兔中发现了一种新的HEV毒株【13】。兔源HEV基因与已确定的哺乳动物4种基因型HEV基因存在较大差异，可能代表一种新的基因型，为肝炎病毒属的第五种基因型。禽HEV被归属为戊型肝炎病毒属中一种假定的新型基因型。但是，欧洲禽HEV由于基因组的差异可以分为三种不同的基因型【141。因此，禽HEV现有的分类可能会重新2 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析校正。禽HEV与哺乳动物HEV基因大概为50％的同源性。在肝炎病毒科中，将禽HEV分类为肝炎病毒科中一种新的单独的基因属而不是种可能更加合适。1．3病原形态HEV是一种小的无囊膜单股正链RNA病毒，形状为二十面体球状颗粒，直径大概为27．34纳米【11。病毒表面分布有刺状的突起和凹陷的缺刻，内部分为两种不同的形态：一种为内部透明型，为缺陷型病毒颗粒，该种颗粒基因不完整；另外一种为内部密集型，该型的颗粒为基因完整型颗粒【151。1．4病毒的培养特性为了能清楚地了解HEV各方面的特征，很多研究机构在多种细胞系上对HEV进行培养、增殖。这些细胞系包括：常用的肝脏细胞系EepG2、HCCM、PLC／PRF5、WRL68和非肝脏细胞系WERO、MRC5。在这6种细胞系中仅PLC／PRF5在增殖过程中能检测强的信号。除此之外，在其它的细胞系上也尝试性地进行培养，如雌性猕猴细胞FRhK、人肺癌细胞A549、二倍体人胚胎肺细胞2BS，但HEV在这3种细胞系内增殖效果均不理想【16】。目前已发现了两种高效HEV培养系统。Tanaka等‘171用6．46x104拷贝数的HEV接种单层PLC／PRF／5细胞，接种后14天在培养基中能检i贝!J至IJHEV，接种后60天在培养基中能检测到9．16x105拷贝数的HEV；当接种8．66x105拷贝数的HEV时，接种后12天能在培养基中检测到HEv，接种后60天病毒量可增殖N8．66x107个拷贝数。Emerson等‘11使用HEVeDNA感染性克隆体外转染9种灵长类动物细胞系，结果发现在7种细胞系里能观察到病毒的复制，用HEV传染的PLC／PRF／5和Huh-7裂解液能使猕猴发生感染。2．分子生物学研究2．1病毒的基因组特征及功能HEV基因大概长7．2kb，两端由5’端和3’端非编码区及PolyA尾巴构成，中间为三个阅读框，分别为ORFl、ORF2、ORF3。其中ORFl编码非结构蛋白，参与一系列的生化功能，比如磷酸转移酶、解旋酶、RNA依赖RNA聚合酶；ORF2编码衣壳蛋白；ORF3为调节蛋白，编码联合磷蛋白的细胞骨架【2，3】(图1．2)。在三个阅读框中，ORF2与ORF3部分重叠，但ORF2，ORF3与ORFl不发生重叠【18】。在病毒基因5’端发现了一个帽形的结构，这个帽形结构在HEV的复制中可能扮演着重要的角色【191。另外，在HEV中还确定了编码ORF2和ORF3蛋白的双顺反子亚基因组mRNA[201。3 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析图1-2HEV基因结构Fig．1—2GenestructureofHEVORFl，位于基因组的5’端，编码病毒非结构聚合蛋白，在病毒的复制起着重要的作用。ORFl包含几种假定的功能区域，包括氨基转移酶、类木瓜半胱氨酸蛋白酶、解旋酶、RNA依赖RNA聚合酶。ORFl聚合蛋白翻译和翻译后处理现在仍没有得到很好的了解。当在杆状病毒内表达时，ORFl聚合蛋白能分解成对应功能的小蛋白。但是，在大肠杆菌表达系统和哺乳动物表达系统内进行表达时，ORFl蛋白没有分解成小的蛋白12¨。因此，ORFl聚合蛋白是作为一个具有多功能区域的单一蛋白还是作为几种被分裂的小蛋白现在仍不是很清楚。最近，在ORFl内确定了一个富含脯氨酸的高变区(HVR)，尽管高变区生物学意义还不是很清楚，但已确定该高变区对病毒在体内或体外的复制都是非必要的【221。ORF2，位于基因组的3’端，编码一个包含有特有信号肽序列和三个潜在糖基化位点的病毒衣壳蛋白。现已证实糖基化位点的突变能够阻止形成感染性病毒颗粒【231。衣壳蛋白477位和613位亮氨酸残基对于形成中和表位是至关重要蒯241。两个抗衣壳蛋白的单克隆抗体部分认识位于578位和607位氨基酸之间相同或重叠的表位1251。据报道，戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白二聚体，E2(394aa-606aa)，和p239(368aa-606aa)包含主要抗原决定簇，用该二聚体免疫猕猴能够对HEV的感染起到保护作用【261。衣壳蛋白包含RNA连接活性【27】，该蛋白和病毒RNA的相互作用可能在病毒衣壳方面扮演一定的角色。4 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析表1-1在基因型、亚型、分离株水平上HEV序列核苷酸的区别Table．1-1Nucleotidedifferences(％)ofHEVsequencesatthelevelsofgenotypes，subtypes，andisolateORF3，编码一个小的，联合磷蛋白的细胞骨架【2引。ORF3的N端与HEVRNA连接及与衣壳蛋白形成了一个络合物【291。ORF3蛋白的C端是多功能的，可能涉及病毒的形态和致病机理【301。抗ORF3蛋白的单克隆抗体能够在细胞培养上清液、血清中捕获到HEV，但是在粪便中不能捕获到，暗示ORF3蛋白处于HEV颗粒的表面【3¨。虽然ORF3蛋白的表达没有要求进行病毒复制，病毒颗粒聚集或体外感染【3引，但ORF3编码一种对于病毒在体内的感染性是至关重要的蛋白【18,33】。禽戊型肝炎病毒尚未被定为新属。禽HEV基因组大概6．6kb长，比哺乳动物HEV基因组短600bp。序列分析显示禽HEV和哺乳动物HEV在基因组功能区域是相当保守的，在禽和哺乳动物HEV衣壳蛋白中也确定了共同的抗原表位【34'35】。2．2病毒的三维结构N端截短的衣壳蛋白，包含HEVORF2112aa一660aa,当在杆状病毒内表达时能够自动组装成空的类病毒颗粒【361。HEV研究最近一个重大的突破是几个研究机构测定了HEV类病毒的三维晶体结构。早期通过冷冻电镜和图像处理技术对类病毒颗粒研究证实衣壳蛋白126aa-601aa对类病毒颗粒的装配是至关重要的【3刚。通过冷冻电镜和图像处理技术检测到HEV类病毒颗粒的晶体结构包含部分ORF3蛋白(70aa-123aa)与ORF2N端蛋白相融合(112aa-608aa)。HEV类病毒颗粒包含两个不同的区域：外壳区域和突出的区域，衣壳表面有一个二十面体‘371。Li等㈣检测了HEV衣壳蛋白的晶体结构突出的区域(E2s)，发现E2s区域包含一个中和抗体识别位点及形成一个对病毒一宿主相互作用起本质作用的紧二聚体。Guu等【39】检测了一个3．5AHEV类病毒晶体结构，发现每个衣壳蛋白包含三个线性区域，形成不同结构元素，分别为：S(连续衣壳)、PI(---重的突出物)、p2(双重的峰值)。每个区域包含一个假定可能与细胞受体发生作用的多糖连接位点。糖分子连接P1区域可能有助于拆卸衣壳和病毒进入细胞。相似的，Yamashita等[40J确定了3．5．AHEV类病毒颗粒晶体结构的分辨率，另外还发现在衣壳蛋白中的Tyr-2885 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析残基在HEV-VLP粒子组装起着至关重要的作用。进一步的突变分析表明，突出的区域包含有中和表位及涉及连接病毒到敏感的细胞上。对晶体结构研究显示HEV衣壳由一个形成病毒衣壳的单一病毒衣壳蛋白二聚体的衣壳粒所形成。该二聚体从病毒颗粒突出与寄主细胞相互作用，连接到细胞的受体并发起病毒感染。对HEV晶体的研究将会增强我们对HEV组装机制和病毒侵入的了解及有助于发展有效的疫苗和抗HEV药物。2．3基因型、亚型、分离株及分布根据氨基酸同源性、地理分布、宿主范围及感染模式能将Genbank上421条序列分为4个主要的基因型，分别为基因型I、II、IⅡ、Ⅳ型。其中基因型I型比较保守，同时又能够分为5个亚型；基因型II型序列较有限，能分为2个亚型；基因型III型和Ⅳ型变异较大，分别能分为10个和7个亚型。HEV为区域性的分布，基因型I型分布在亚洲，非洲热带和亚热带国家，主要为人源HEV；基因型II型为人源HEV，1986年首次在墨西哥爆发非A非B肝炎病人的粪便中被确赳31，除墨西哥外，在尼日利亚、乍得也发现基因型II型的分布⋯；基因型III型呈世界性分布，在亚洲、欧洲、大洋洲、北美和南美洲均有分布，基因型III型被假定起源于西半球，在亚洲国家比如日本、韩国、台湾的分布均为从西半球输入。而基因型Ⅳ型为本地株HEV，仅限于亚洲分布【42】。另外，最近还确定了禽戊型肝炎病毒，主要感染鸡和火鸡，进行序列同源性比较发现它与人源和猪源HEV核苷酸同源性约为50％。1990年首次对HEV进行克隆和测序，测序株为缅甸株【2】。紧接着对其他区域得到的HEV进行了基因测序[43,44】。基于Lu等【42】所构建的进化树，通过核苷酸的平均变异程度可以将HEV在三个水平进行区别，分别为：基因型、基因亚型和分离株(见表1．1)。在传播方式上基因型I型和II型与基因型III型和Ⅳ型存在着明显的不同，基因型I型和II型为流行性HEV，而基因型III型和Ⅳ型为动物传播性HEV。基因型III型和Ⅳ型核苷酸变异范围比基因型I型和II型大。对核苷酸的全基因序列进行比较，在基因型、基因亚型、分离株3种水平的区分能产生比较理想的结果。在基因型水平上，基因型III型和Ⅳ型核苷酸的变异程度为23．9-26．7％，亚型变异范围为12．1—18．0％，分离株水平为5．8_10．2％，在基因型和亚型水平是5．9％，分离株和亚型是1．9％。对ORF25’端核苷酸的变异进行三个水平的划分，得到的结果与全基因比较得到的结果是相似的(基因型水平：22．1_26．7％，亚型水平：12．6-19．8％，分离株水平：2．0-lO．1％)，在基因型和亚型水平是5．9％，分离株和亚型水平是6 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析1．9％。然而，比较ORFl5’端和3’端及ORF2的3’端序列，得到的结果部分重叠，基因型水平分别为：18．8_23．6％，23．∞8．2％，20．9—23．5％，基因亚型水平分别为：11．5—20．O％，11．化2．8％，12．9-19．3％，分离株水平分别为：5．1—11．8％，7．o-12．1％，5．6-14．8％。从而确定ORF25’端(对应分离株M732185994bp一6294bp)在分型方面比其它三个区域更能准确的反映全基因序列在HEV的分型。HEV基因型I型被分为亚洲亚型(包括中亚簇和南亚簇)和非洲亚型【45,461，或者亚型la至lJle，是非常保守的，基因型II型的分型也是保守的。I、II型在亚型水平平均核苷酸的变异与表1．1在基因型III型和Ⅳ型所观察到的结果相似。通过各种病毒核苷酸变异程度来划分基因型和基因亚型通常是必要的。比如，基于全基因序列，当HCV戈U分为基因型时，核苷酸变异程度为31-33％，当分为亚型时，核苷酸变异程度为20一25％147,48】。HAV进行分型核苷酸变异相对较低，基于vPlⅣP2连接区域的部分基因序列，当划分为基因型时，核苷酸变异为15％，当划分为亚型时，核苷酸变异为7．O．7．5％1491。然而，对于HEV通过核苷酸的变异来划分基因型、亚型、分离株还⋯没有被很好的确定。通过分析HEV全基因或ORF25’端核苷酸序列，基因型I、II型，变异程度达到22．1．26．7％可分为基因型，达到6．2．13．45％分为基因亚型。基因型IⅡ、Ⅳ型，变异程度达N12．1．19．8％时分为亚型。基于这种评估，基因型I型能分为5个亚型，基因型II型能分为2个亚型，基因型III型能分为lO个亚型，基因型Ⅳ型能分为7个亚型。按照字母先后顺序排列，基因型I型分为：1a、lb、lc、ld、le5个亚型；在基因型II型分为：2a、2b2个亚型；基因型IⅡ型分为：3a、3b、3c、3d、3e、3f,39、3h、3i、3j10个亚型；基因型Ⅳ型分为：4a、4b、4c、4d、4e、4f,497个亚型。在进行亚型划分时，基因型I、II型要求核苷酸变异程度明显比基因型III、Ⅳ型要低，这个问题还有待于解释。HAV和HEV均为造成自限性疾病的RNA病毒。另一个重要的RNA病毒HCV，大部分急性感染病人能发展成慢性感染。在核苷酸变异划分为亚型方面，HEV基因型I、II型与HAV有着相似的核苷酸变异范围，HEV为6．2．13．45％，HAV为7．0．7．5％。相反，基因型III、Ⅳ型和HCV相似，在基因型亚型划分方面它们都有着比较广的核苷酸变异范围，HEV为12．1．19．8％，HCV为20．0．25．0％。HAV和HEV基因型I、Ⅱ型通常通过污染提供的水源或食物，导致了病毒有效的传播从而造成肝炎爆发或流行149，501，相似的传播模式在相似的病毒能产生相似的基因变异程度。而HEVIII型和Ⅳ型的变异主要是在动物内维持，仅偶尔感染人类，可能是该病毒在种间的传播不是很有效。对于上述的解释可能是该病毒长期在不同区域循环，以及在动物物种有着自己独立的进7 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析化方式。HEVIII型和Ⅳ型非常的不同，它们有着不同的地理分布。在这个意义上，HEV基因型Ⅲ型和Ⅳ型与部分HCV变异体是相似的。3．传播方式3．1潜伏期对志愿者口服摄／X．HEV后的调查发现，HE在人的潜伏期为4．5周【5l】。2．10周轻微变动的潜伏期时间也有报道【81。3．2HE在人群里的传播途径引起HEV感染的四种传播途径已经被确定。分别是(1)污染饮用水引起感染的粪口途径；(2)食源性传播；(3)输入感染有HEV的血液；(4)垂直(母体．胎儿)传播。当然，通过污染水源进行传播是最普遍的。在一些病例中，特别是在HEV非流行区域和散发性病例流行区域，要去确定HEV感染的途径是非常困难的。在不同的地理位置发现了两种不同的流行模式。这些模式看起来与疾病流行是相对应的。在流行区域或非流行区域各种传播途径的频率，人群的感染和几种疾病的特征值得分别讨论。3．2．1HEV在疾病流行区域的传播途径在这些区域，HE流行比较频繁，通常都间隔几年。在印度次大陆、中国、东南亚、中亚、中东、非洲的北部和西部地区均发现有HE的爆发。在北美(墨西哥)，1986．1987年间出现两次小的HE爆发，此后再没有发生过。HE爆发常常是大规模的，影响成千上万人的生活【8‘91。大部分报道有关的HE爆发都与饮用粪便污染的饮水有关。HE流行的时间有从持续几周的单峰爆发到持续几年的的多峰流行【8,52】。后者为持续的水污染引起。HE爆发通常是在能将人粪和饮用水混合的大雨和洪水发生后爆尉8，91。部分爆发是发生在热和干燥的夏季月份，可能是由于河流减少增；bn-f水中粪便污染物的浓度‘521。在东南亚HE流行的再次发生可能是由于当地居民随意将粪便排泄物排到河里，同时又使用同一条河的河水作为饮用水、烹调和个人洗漱所致【53】。这些生活方式提供]"HEV持续污染水源的条件。HE在不发达的城市地区发生可能是由于该地区使用易漏的水管，且水管穿过被污水污染过的土壤，在这些地区间断的水供应导致在没有水流的情况下水管中出现了负压从而内吸了污染物‘541。尽管HEV感染通过污染的食物进行传播是可能的，但在HEV流行区域通过食源引起HE的爆发相对较少。可能是由于HE需要相对较长的潜伏期(至少10周以上)，因此很难8 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析在食用HEV污染的食物与发生HE之间建立关系。HE爆发的总感染率在1．15％之间，在成年人的感染率最高(3．30％)，对于这个现象的原因现在不是很清楚。在小孩子，HEV的攻击率是相对较低的，可能是由于高比例的无症状感染而不是稀少的感染。在大部分的HE爆发中，男性要高于女性，这可能是由于他们有更多暴露接触HEV的机会或者一旦感染HEV后更倾向于表现出临床症状。HE爆发在怀孕妇女引起高的感染率和死亡率。在印度的詹木喀什米尔发生了一次大的HE爆发，怀孕妇女在妊娠末1个月，2个月和3个月的感染率分别为8．8％，19％，19％，感染率比非怀孕妇女(2．1％)和男性(2．8％)都明显的甜41。此外，在那些开始表现为肝炎综合症，紧接发展成爆发性肝炎的病人中，怀孕妇女的比例也明显的高。但是一旦发展成爆发性肝炎，HE或其它引起肝损伤的因素在怀孕妇女引起的死亡率就没有明显的不同1551。尽管怀疑与免疫或激素分泌有关【56，571，但HEV在怀孕妇女的偏爱性的真正原因现在仍不是很清楚。在怀孕期间感染HEV与早产、出生体重低、围产期死亡率增加也是相关的。在HE流行区域，HEV感染在所有年龄的人群中急性散发性肝炎占了很大的比例。在印度，HEV感染是造成急性散发性肝炎最主要的原因，在成年人急性散发性肝炎中HE占70％t5引。在这些区域，患有HE的病人与流行性HE在年龄分布、严重程度、持续的发病、怀孕妇女不良预后及不发展成慢性肝炎等方面是非常相似的。大部分散发性病人感染HEV的途径现在不是很清楚。然而，在这些地区很大的可能性是由于HEV污染水或食物。在不同的季节，研究者对印度一个大城市中大排水沟里的污水进行检测，结果发现40％的污水中能扩增至JJHEV的基因片段1591，这就暗示了HE在人群中在不出现HE爆发的情况下也普遍循环着。不像其他几种肠道传播疾病，尽管HE是流行或散发通过人与人接触传播是稀有的【60,61】，确切的理由现在还不是很清楚。HE爆发期间，在同一家人里，健康易感人和病人接触引起HE的二次发病率非常低，大概为0．7．2．2％；而相似病毒HAV，在同一家人通过接触引起的感染率为50．75％，甚至在同一个家庭中有多个人发病，他们发病时间间隔也是非常的短，提示了他们有最原始的水源性感染源，而不是通过人与人之间接触传播【601。HEV感染从母体到胎儿的传播方式也有报道。在一个研究中，8位妊娠末3个月患有急性散发性肝炎的妇女，出生的8个婴儿中有7个显示有感染HEV的证据，检测结果显示能从婴儿中检测到HEVI州A或抗HEV_IgM抗体【62】。在HE流行区域，已经证实在健康血液捐赠者的血液中能检测到HEV病毒及通过输血的方式将HEV传播给血液接受者。9 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析在流行区域，动物性传播HEV的角色现在仍不是很清楚。3．2．2HEV在疾病非流行区域的传播途径在HE'lIE流行区域，至今尚无HE爆发的报道，HE在已经报道的急性病毒性肝炎中所占的比例也非常小。然而，在最近几年，单独或小连续发生地本地传播毒株在美国、欧洲(包括英国、法国、荷兰、西班牙、希腊)和亚洲．太平洋发达国家(日本、台湾、香港、澳大利亚)被确定。对英国40例连续发生的HE病例调查发现，HE发生伴随着季节的变化，春天和夏天为发病高峰期，十一月和十二月没有HE的发生【63】。在英国，HE的发生在海岸和河121地区的居民比较常见畔1。尽管动物性传播已经被提出【631，但大部分这些病例HE的传播模式仍没有被确定。HE通过动物性传播在美国首次被提出。对美国两例本地病例进行检测发现分离株的序列与人源HEV分离株相比更接近于猪源HEV[65,66】。通过用人源HEV感染猪，和用猪源HEV感染灵长类动物【66,67]得到进一步支持。最直接的证据是，日本一例病例在发病前几周食用了没有充分煮熟的鹿肉【6引，对病人HEV分离株和剩余冻存着鹿肉的HEV进行基因测序，发现两毒株为100％的同源性，从而确定食源性感染【691。此外，从鹿肉得到的HEV基因序列与处于相同森林中的野猪及另外的野鹿得到的HEV序列同源性高达99．7％，提示-]"HEV在这些动物种类中传播及从鹿传播给人【70】。从那之后，又发现了几条证实在非流行区域存在动物性传播的证据。在一个研究中，在日本零售店销售的363份猪肝中检测出了7份HEVRNA阳性的样品，分别属于基因型III型和Ⅳ型L71】，这些分离株的同源性与先前分离到的人源HEV分离株的同源性非常的高。在美国，销售的猪肝也检测到HEVRNA，对127份肝脏样品进行检测，检测到了1l份基因型III型的HEVRNA[721。另外一些研究中发现污染的贝类海产品可能是HEV传播的一种途径。3．3种问交叉感染猪源基因型III型和Ⅳ型HEV能够跨过物种障碍感染猕猴和猩猩【6，671。相似的，人源基因型III型和Ⅳ型也能感染猪【．71。基因型I型和II型在宿主方面是非常有限的，仅限于感染人，用人源基因型I型和II型攻毒猪不能引起猪感染【73】。HEV的种间交叉感染在其它的动物已经被报道，用人源HEV能够成功感染羔羊和大刚74，75】。像基因型III型和Ⅳ型一样，禽HEV也能跨过种间障碍，从鸡分离到的HEV能成功感染火鸡【_76】，但用禽HEV感染猕猴没有得到成功【341，提示禽不像猪源HEV有很宽的宿主范围，可能不会感染人类。10 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析HE现在已经被确认是动物传染病，猪和其他很多种类的动物是HEV的宿主【121。在发展中国家或发达国家的猪群处理者如猪场的农民、猪兽医等显示有感染HEV的高风险性，比如在美国猪兽医抗HEV抗体阳性率是相同年龄相同地区正常血液捐赠者抗体阳性率的1．51倍【5】。来自传统养猪国或区域人群的抗体阳性率要比非养猪国人群抗阳性率高，比如明尼苏达州，一个主要的养猪地区，人群抗HEV抗体阳性是非养猪地区．阿拉巴马州人群抗体阳性率的5倍到6倒51。据报道，在摩尔多瓦51％猪场农民是抗HEV抗体阳性，而与养猪业职业不相关的对照组抗HEV抗体阳性率为25％。Withers掣7。7】报道，在北卡罗莱纳9、1'1猪场的工人抗HEV抗体阳性率(10．9％)比对照组(2．4％)高4．5倍。另外，从宠物猫或宠物猪将HEV传播给人也有报道【7引。越来越多动物源HEV株被发现，动物传染病的潜在性必须被完全地评估。了解HEV的自然生态和历史将有助于为阻止和控制HEV在人类的感染提供理论基础。4．临床表现HEV感染的临床特征跨度非常的大，从无症状亚临床感染到伴有急性肝衰竭和高死亡率的严重肝炎。在发展中国家，与基因型I型和II型相关的地方性肝炎在年轻的成年人中经常发生；而基因型III型和Ⅳ型有关的临床HE，病人通常是60岁或大于60岁的人群‘791。在大部分的病人中，急性感染潜伏期大概是3．6周，临床特征包括从亚临床肝炎到伴有黄疸、厌食、恶心、呕吐、偶尔发烧的胆汁淤积性肝炎，持续1．6周。在高和低HE流行区域，所有HE的病例中大概有1％的病例发展成严重的对生命造成威胁的急性肝衰竭。然而，在怀孕妇女有最高的发病率和死亡率。4．1在疾病流行区域的临床表现HEV感染所引起的临床结果非常不一致。HE常见的表现是自限性、急性黄疸性肝炎，该特征与其他肝炎病毒引起的急性肝炎有明显的区别。在一定比例的病人中，病情非常严重并发展成爆发性肝炎(急性肝衰竭)。怀孕妇女感染HEV提高了HE的严重性。在动物试验中发现，攻毒剂量决定了肝脏损伤的严重程度，低剂量的攻毒引起亚临床感染【80】，然而相关的研究在人没有进行研究。尽管有些病人病情稍长并伴有明显的胆汁淤积表现，但疾病通常仅持续几周。HE流行区域，在没有发生急性肝炎记录的居民中也能频繁的检测到抗HEV抗体，暗示了无症状或不明显感染是非常普遍的。居住在HEV爆发地区的居民，受HE影响但不发生黄疸性HE支持了这种发现。 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析在流行区域，先前患有其他病原体引起慢性肝病的病人受HEV感染后可能导致重叠的急性肝损伤和在慢性肝病上的急性临床表现。我们发现，在印度最近发生的HEV感染，将近一半是这类病人【81】。这些病人存在着预后不良的高可能性。部分这些病人中，在HEV感染后可能首次检测到先前不表现症状的慢性肝病病原体。在发表的报告中，感染病例死亡率在0．5．4％之间。然而，这些数据可能受到筛选偏差，这些数据是来自疾病发展较严重的住院病例的数据。在疾病爆发期间的人口调查中发现，死亡率在0．07．0．6％之间【52,82】。4．2在非流行区域的临床表现在HE非流行的国家，对不明病因肝炎患者进行血清学检测时发现，HE是最常见的病因。在这些病人中，临床特征通常与流行区域病人的临床特征相似。来自英国的一系列病例，大部分确认感染HEV的病人都表现出黄疸，少部分是无特异症状或转氨(基)酶升高的非黄疸病例【63】。有的病例刚开始被认为是由于药物引起肝损伤，直到检测才发现肝损伤是由于HEV感染引起【83】。在这些区域，大部分病人是患有其他疾病的中年到老年的男性【洲。4．3慢性肝炎和器官移植不像乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒，HEV造成的肝炎不会发展成慢性的肝炎，通常仅造成自限性急性病毒性肝炎。然而，最近的研究显示会发生持续的HEV感染，特别是在免疫抑制器官移植接受者。Kamar等【85】最近调查了14例接受免疫抑制药物的实质器官移植接受者(7例无症状，7例非特异性症状)，8例发展成慢性HE，可以检测到转氨基酶水平升高。在这14例病例中，有8例发生了持续的病毒血症和肝酶升高。对部分非特异性症状的病人进行肝脏活检，结果显示为高密度淋巴细胞浸润和不同程度零碎坏死和纤维化的肝门肝炎。器官移植后很短的时间内病人就发展成慢性肝炎，与恢复期HEV感染病人相比，CD2、CD3、CD4淋巴细胞总量减少【851。在一项回顾性研究中发现2个肝脏移植病人感染HEV，发展成了慢性HEl851，其中一个病人肝脏移植后2个月发展成了不能解释的慢性HE，进一步发展成了肝硬化，7年后该病人肝脏需要再次移植，及慢性肝炎也再次发生。肝脏移植三周后在病人的血清中能检测到基因型III型的RNA以及病毒在肝脏再次移植后仍然保持阳性。另外～位病人在肝脏移植后也发展成了不能解释的慢性肝炎，5年后肝脏需要再次移植。慢性肝炎发生到肝脏再次移植期间也同样能检测到HEV基因型ⅡI型的RNA[861。最后这2个器官移植的病人也发生了快速进行性HEV关联的肝硬化。一个肾脏移植的病人在肾脏移植后60个月发生了急性病毒性HE，通过检测到不断12 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析升高的肝酶水平和在血清中检测到HEVRNA得到确认。另外一个肾脏移植病人在肾脏移植36个月后也发展成了慢性肝炎，并且持续了38个月，在病人的血清和粪便样品中均能检测至UHEVRNAl871。在一个独立的回顾性研究中发现，一个进行抗T细胞淋巴瘤化学性治疗的病人在血液输送时感染],"HEVl8引，从而发展成慢性的HEV肝炎。血液捐赠者HEV基因序列与输血后170天感染HEV病人的HEV基因序列是一致的；一个患有成淋巴细胞白血病的病人在进行同种异体干细胞移植14周后也感染YHEVt891。在试验条件下，对鸡进行禽HEV攻毒和对猪进行猪源或人源HEv攻毒‘72,901，结果显示在攻毒动物中有少量鸡或猪能够长期观察到病毒血症和在粪便中能检测到HEVRNA。总之，这些最近的研究已经暗示了免疫抑制的病人能够发展成慢性HEV感染。在免疫功能不全的病人如器官移植接受者和癌症病人，急性感染HEV后不仅能够发展成慢性肝炎，而且能发展成快速进行性肝硬化。在这些病人中，部分呈抗HEV抗体是阴性的网可能是由于免疫抑制的原因。值得注意的，目前所有慢性肝炎的报道都是发生在免疫抑制的病人，且都属于HEV基因型ⅡI型。更进一步研究能引起全球HE发生的病原体—-HEV基因型I型，是否能在其他健康的人群中持续感染是非常必要的。4．4动物HE临床表现除已经报道在俄国一头试验攻毒猪表现出严重的黄疸性肝炎外，在其他盛行HE的猪群或试验攻毒猪中均未发生临床症状【9l】。除猪外，在其它的动物也报道-j"HEV感染，也未发现HEV感染能引起明显的临床症状。5．HE流行病学调查HE不仅在亚洲、非洲【50,921的发展中国家是严重的公共卫生问题，偶尔也在发达国家如美国【矧、希腊【93l、日本【94】、澳大利亚【951和新N-z-_1961出现散发性感染。5．1HE在国外的流行情况Huang等f97】通过RT-PCR的方法对美国37个不同猪场96份2-4月龄猪血清和粪便进行检测，结果显示54％的猪场存在HEV感染，HEVRNA阳性率为35％。说明了HE在美国猪群较盛行。Cooper等[98】为了了解墨西哥猪群HEV的流行情况，对2．4月龄猪血清和粪便进行检测，结果显示血清中HEVRNA阳性率为6．4％(8／125)，粪便HEVIⅢA阳性率为30．4％(28／92)，另外81％猪只能检测到抗HEV-IgG。进化树分析显示所有分离株均属于基因型III型。该研究发现的基因型与墨西哥人群中流行的基因型不同，墨西哥人群中流行的 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析基因型为II型，提示猪对基因型II型不易感。deDeus掣叫对西班牙的研究发现，在69头研究猪中，26头猪至少在一份检测材料中能检测到HEVRNA，阳性率为37．7％，暗示了西班牙猪群HEV感染相当普遍。在所有检测样品中，胆汁最容易检测至IJHEV病毒，然后按顺序是肠系膜淋巴结、肝脏、粪便、血清。23头1月龄猪中有7头能检测到HEV病毒，17头2月龄猪中有8头能检测到HEVRNA，20头3月龄猪中有11头能检HEVRNA，小于1月龄或大于3月龄没有样品能检测到HEVRNA。通过组织学检测发现有肝炎病变的肝脏样品与胆汁和淋巴结HEV检出样品统计学相关，但与肝脏、血清和粪便阳性率无明显关系。另外还发现HEV感染与PCV2感染与否没有显著的关系。dosSantos等【1001在研究中发现所有刚出生未哺乳初乳的乳猪均为HEV抗体阴性。哺乳初乳后24d,时，绝大部分的乳猪能被动获得抗体(92．3％，24／26)。16周时大部分仔猪母源抗体消失，为抗体阴性，但在22周时阳性率达到88．4％(23／26)。母猪分娩后未哺乳初乳的仔猪对HEV是敏感的，该结论与Wagstrom等【10u的发现相一致，说明在怀孕期间不能被动转移母源抗体至胎猪，但是哺乳初乳后很快就能被动获得抗体。使用ISH方法对自然感染猪不同组织进行HEVRNA检测，结果发现肝脏是检出率最高的样品，其次按顺序是大肠、小肠、胆管、脾脏、淋巴结、扁桃体、肾脏‘102】。Kaci等【103】通过实时PCR和RT．PCR对德国1995．1996年用于血清监测的野猪血清进行检测，结果发现实时PCR检出率为5．3％(10／189)，RT．PCR检出率为3．1％(6／189)。暗示了在欧洲中心野猪是HEV储存宿主之一，且十年前HEV对德国动物的感染是非常普遍的。Kabrane．Lazizi等【l叫采用ELISA的方法对美国野外捕获的野鼠进行血清流行病学调查，结果发现在马里兰捕获的83只野鼠抗体阳性率为77％(64／83)，在夏威夷岛捕获的16只野鼠抗体阳性率为94％(15／16)，在路易斯安那捕获的9只野鼠抗体阳性率为44％(4／9)。在HEV流行国家如索马里、塔吉克斯坦共和国、土库曼苏维埃社会主义共和国，奶牛抗HEV抗体阳性率为29．62％。在二IIZHEV流行国家如乌克兰奶牛抗HEV抗体阳性率为12％【10Sl。Hamdy等‘1061最近通过ELISA和PCR的方法对埃及开罗劳动用马进行了流行病学调查，在收集的200份马血清中26份为抗HEV．IgG抗体阳性，阳性率为13％。HEVRNA检测发现4％为病毒阳性(4／100)。进化树分析显示所有的分离株均属于基因型Ⅳ型，且14 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析与当地人源HEV同源性为97．100％，提示了当地存在种间交叉感染的可能性。以往的研究发现，在越南、印度两个HEV流行国家，抗鸡HEV抗体阳性率为40％和98％t1051，在脏V非流行国家(美国)鸡抗体阳性率为30％【1071。最近，在巴西检测到鸡群抗HEV抗体阳性率为20％(5／25)tlos]。Hirano等【1091对收集的多种非人灵长类动物进行血清学调查，结果发现在232份日本猴血清中，抗HEV-IgG阳性率为36．2％(84／232)；在19份食蟹猴血清中，抗体阳性率为10．5％(2／19)：在83份猕猴血清中，抗体阳性率为3．6％(3／83)；在l份台湾猴血清中，阳性率为100％(1／1)。5．2HE在国内的流行情况1986年7月至1998年4月，在我国新疆回族自治区南部发生了HE大流行，引起了12000人感染，707人死亡【1101。在这次流行tgHEV在国内首次被认识【82】。大量IYJHEV序列被分析，基于部分或全长序列进行分析，所有HEV分离株均属于基因型I型431。“等‘1111对中国18个市进行HEVRNA检测并进行进化树分析，结果显示在分离的98一株中，63．3％为基因型I型，36．7％为基因型Ⅳ型。但最近多个报道已经描述从1999年至今人源和猪源基因型Ⅳ型HEV已经传遍中国大部分地方【112圳41，为中I雪HEV主要基因型。最近研究显示，基因型Ⅳ型能自由地在人群和猪群中循环，且人感染HEV的风险与猪相关职业密切相关【1151。“等‘116】收集北京5个郊区10个大规模的猪场血清376份、20个家养式小规模猪场血清100份，1个屠宰场血清162份及肝脏样品114份。通过万泰ELISA诊断试剂盒对血清进行抗HEV抗体检测，结果显示，所有猪场血清阳性率为79．4％(378／476)，各猪场血清阳性率在47．5．100％之间，其中几乎一半大猪场血清阳性率达100％(4／10)。屠宰场血清阳性率为78．4％(127／162)，几乎与北京猪群血清阳性率相同。所有样品按年龄分组，可分为1．3月龄组、3-6月龄组和大于6月龄组。在大猪场中各组血清阳性率分别为68．1％、84．5％、87．0％；在家养小猪场中，各组血清阳性率分别为91．1％、90．5％和88．2％。结果显示大部分的猪在1．3月龄被感染。Zhang等‘1171对中国上海不同种动物进行血清学检测，发现在母猪中感染率为82．5％(222／269)，4-6月龄猪感染率为53．9％(104／193)，1．3月龄猪感染率为63．4％(168／265)，屠宰场猪群感染率为55．7％(34／61)，山羊感染率为24％(12／50)，马感染率为16．3％(8／49)，宠物狗感染率为17．8％(21／101)，奶牛感染率为6％(6／100)，鸭感染率为12．8％(6／47)，鸽子感染率为4．4％(2／45)，鸡感染率为1．9％(2／105)。免疫抑制试验显示除了鸽子和鸡血 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析清外，其它的动物血清都显示能与HEV或类HEV发生反应。从血清中分离到了18株猪源HEV病毒，从马血清中分离到1株HEV病毒。序列分析显示分离到的马HEV和1株猪源HEV属于基因型III型，其它均为基因型Ⅳ型。W锄g等11181收集北京、河南、浙江、广东、河北、天津、广西和新疆猪血清490份，收集北京、天津、山西牛血清190份，收集上海、新疆山羊血清316份，通过ELISA进行检测，结果显示猪血清阳性率为78．8％，牛血清阳性率6．3％，尽管有120份羊血清是从在1988．1990年爆发HE大流行的新疆采集，但在羊群中未检测到抗HEV抗体。Li等⋯6】通过血清学和分子生物学的方法对北京处于不同饲养环境的猪群及屠宰场收集的血清和肝脏进行检测，结果发现在收集的血清样品中，规模化猪场血清阳性率为76．6％，传统家养模式的猪场血清阳性率为90％，屠宰场收集的血清样品阳性率为78．4％；在屠宰场收集的114份肝脏样品中有4份为HEVRNA阳性，阳性率为3．5％。暗示了北京HEV在猪场中的感染非常盛行，且饲养条件低下有利于HEV的传播与流行。在中国，超过1000头猪的养殖场被认为是专门的商业猪场，20．50头猪的猪场被认为是传统饲养的家庭式规模猪场。现在传统的家庭式猪场占据总猪生产的70％。Li等【l16J发现家庭规模饲养抗HEV抗体阳性率明显要比规模化猪场抗体阳性率高(76．6％-90％)。这个发现与卫生条件和饲养条件低下的家庭规模饲养提升HE盛行的假设相一致15们。因此，建议在中国加速养猪业现代化进程，提高猪圈卫生条件并加强定期消毒。Ning等t119】对上海不同地区5个猪场的65份粪便进行PCR检测，结果显示15份为HEVlⅢA阳性，进化树分析显示7株为基因型III型，8株为基因型Ⅳ型，说明了上海出现了不同基因型共存的现象。Zhu等【120】对中国吉林7个不同区域，2003—2006年4654份不同年龄人群血清样品进行抗HEV抗体检测，结果显示1289份血清样品为阳性，阳性率为27．7％，其中男性感染率为37．2％，女性为18．4％，男性感染率明显高于女性，提示在吉林HEV的感染是非常盛行；对不同职业人群感染率分析显示，阳性率在猪场人员、其他乡村人群、屠夫、医务人员和其他市区的人群分别是40．5％、29．1％、57．3％、40．O％和6．9％。敏感人群如医务人员、屠夫抗体阳性率较高，说明了存在感染HEV更高的风险性；对180位抗HEV—IgM进行调查，结果发现男性感染率是女性的3．9倍。对不同月份抗HEV．IgM阳性率进行调查，发现8月、9月和lO月为高峰感染阶段。对不同年龄感染率调查发现，20．69岁感染率较高，10．19岁或大于70岁感染率相对较低。在吉林8月至11月是四季交替的大陆季风气候，此时雨量非常的充沛，HEV感染可能与这个季节下雨密切相关。16 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析5．3HE在广西的流行情况以往的一个调查显示，基因型I型在广西是大部分HEV散发性感染的基因型【1111，值近年来基因型Ⅳ型开始起主导作用。Li等【1131对2003．2004年中国南方人群HEV感染情况进行调查，发现基因型Ⅳ型为主要的基因型，基因型Ⅳ型快速的进化可能是动物传染病的结果。先前已经报道在中国广西流行两个亚型的基因型Ⅳ型HEV，分别以swGX40和swGX32为代表株，其中以swGX40为代表株的亚型占明显优势，为广西的优势流行毒株【1211。“等⋯31对中国南方散发性急性病例进行检测，在24例病例中发现有23例分布在以swGX40为代表株的亚型中。Ji等【1211对广西8个农村地区120份2．4月龄猪粪进行RT．PCR检测，结果显示在120份粪便样品中有29份为HEVRNA阳性，阳性率为24％。该研究选取了两份阳性样品进行试验攻毒猕猴，攻毒后两只猕猴都发展成THE，表现出血清丙氨酸氨基酸转移酶上升、病毒血症、粪便病毒排泄等，暗示了在该区域猪HEV能够种间交叉感染，当地居民处在感染猪源HEV的风险中。韦献飞等【1221于2008年通过使用RT-nested．PCR对广西地区3月龄以下狗、猪粪便及龙虎山自然景区猴粪便、鱼胆汁、鼠肝组织进行HEVRNA检测，结果显示仅3月龄以下猪粪便标本检测出HEVRNA，阳性率为10．08％。陈敏玫等【123】于2003年11月至2004年12月，通过ELISA方法测定广西地区556只各种品种野鼠外周血抗HEV抗体，结果显示阳性率高达16．2％。韦献飞等‘124】于2005年一2006年通过使用ELISA方法检测猪、鼠、狗血清标本共534份，结果显示总抗HEVIgG阳性率为31．84％，其中猪阳性率为26．40％，鼠阳性率为43．02％，狗阳性率为25．71％。樊金萍等‘1251于2007年从广西5个市采集211份野鼠血清，采用双抗原夹，t],ELISA方法对血清样品进行抗HEV检测，结果显示野鼠血清抗HEV的抗体阳性率为6．6％。Li等【113】采用ELISA的方法对广西当地的居民进行血清流行病学调查，结果显示当地居民抗HEV抗体阳性率高达43％，提示在这些区域HEV感染较流行。在中国南方地区，居民常常把猪饲养在离居民房子旁边的猪栏里，存在着HEV从猪传播给人的可能性。6．诊断确定HEV感染的诊断方法基本上都是围绕检测抗HEV抗体来区分是最近感染还是17 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析过去感染的血清学方法(IgG和IgM)。现在已经发明了能检测基因型I型到4型抗体的ELISA方法。在血清中仅出现抗HEV特异性IgM而不出现IgG暗示为最近的感染，而在血清中出现抗HEV-IgGj7ii没有IgM贝JJ暗示了为过去的感染。抗HEV特异性IgA过去被用来确定HEV的急性感染，现在用来确定急性感染是值得怀疑的。对免疫抑制病人进行HE诊断是困难的，因为在这些病人中血清阳转会发生推迟甚至完全缺失‘86，126】。具有正常免疫功能的人感染HEV后1．3周内会出现抗HEV抗体，但相反的是，免疫抑制病人血清阳转可能要推迟到6．10个月。这样，对于感染HEV的免疫抑制病人结合使用血清学和核苷酸检测方法是必要的。扩增位于OIU2内189bp片段的巢式或实时定量PCR青g够在血清或粪便中检测到病毒RNA，特别是在急性感染和HEV感染的第一周内。尽管粪便排泄病毒能够持续2．3个月，但在血清中检测HEVRNA时间可能非常短(发生症状后的10．30天)。6．1抗HEVIgG检测方法最早的血清学检测方法是利用了不同毒株的HEV抗原。这些抗原包括合成肽或HEVORF2和ORF3编码的结构蛋白和非结构蛋白【1271。在HEV流行区域和非流行区域用来研究HEV感染的流行病学是非常广泛的。这些方法尽管有非常好的特异性，但是敏感性不是很稳定【1281。目前，检测基于HEVORF2的抗体被一致认为有比较广的活性，在不同的实验室也能产生很好的重复性数据【5，1291。一个检测抗基因型I一Ⅳ型假定中和抗体的ELISA方法己经被描述【1301。这个方法针对抗HEV中和抗体有很高的特异性，对HE疫苗试验产生的体液免疫和持久的免疫反应进行定量是特别有用的。两种全球范围可用的商qpHEV．IgG抗体检测方法分别是：Abbott免疫球蛋白G检测方法和GenelabslgG检测方法。这两种检测方法有足够的敏感性和特异性[131】。6．2抗HEVIgM检测方法几种内部抗HEVIgM检测方法已经被描述【127，1321。抗HEVIgM的理想检测方法应该是敏感的，没有假阳性，在疾病发生后能检测的时间性不是很长(能持续2个月)及能区别为最近(急性)感染还是过去感染。具有上述所提及特征的方法先前已经被描述【1331，这个抗HEVIgM的检测方法检测急性期病人特异性超过95％，通过检测病人血清HEVRNA可以得到确认，同时这个方法能够计算IgM／IgG的比例从而准确的检测到HEV的感染。6．3抗HEVIgA检测方法1993年首次描述了检测抗HEVIgA的固相ELISA方法【1341。该方法用来研究索马里爆发肠道传播肝炎病人的血清【1351。这个方法被作为抗HEVIgM检测方法的附加方法，可 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析诊断最近的HEV感染。从那时起，其他的调查者开始利用这个方法，且发现单独进行抗HEV[gA检测或结合抗HEVIgM检测进行急性HEI仃I．清学诊断是很有用的，能提高诊断的特异性。令人惊奇的是，Herremans掣1361认为抗HEVIgA在血清学诊断方面价值有限，特别是对基因型IⅡ的诊断。6．4HEV抗原诊断方法现已发明了一种使用抗HEV重组单克隆抗体检测血清中HEV抗原的间接ELISA方法。这种抗原ELISA方法用来检测HEV基因型I型和Ⅳ型的衣壳蛋白。试验攻毒猴子在氨基酸转氨酶和抗HEV抗体出现前能检测到HEV抗原。这些抗原的检测时间与粪便中出现HEVRNA几乎在同一个时间，但是持续的时间比粪便HEVRNA持续的时间短4周。这个方法对于抗HEV血清阳转窗口期的诊断是有价值的。6．5HEVRNA检测方法在进行性HEV感染时最可靠的标记是在血清、胆汁和粪便样品中呈现HEVRNA。在感染HEV后6．40天，氨基酸转氨酶升高及HEV抗体出现的前几天均能检测至UHEVRNA[1371。在部分亚临床感染的病人qbHEVRNA的呈现是唯一证实感染HEV的证据【1321。多种RT．PCR检测方法能够对HEVRNA进行检测。由于HEVRNA在感染病人中的量比较有限，因此对靶信号进行扩大的方法是必要的。I盯．PCR就是对靶信号进行扩大的方法【1381。许多RT．PCR的方法可以是定性检测也可以是定量检测。定性检测方法被用来检测HEVRNA，也是用来确定或诊断进行性HEV感染的方法。其中一种定性检测利用了基于缅甸株、墨西哥株和美国株保守序列设计的通用寡核苷酸引物去对三个ORF进行扩增‘1391。另外一个定性的RT—PCR检测方法能够扩增4种已知的基因型HEV[1401。定量HEVRNA检测方法利用实时定量PCR进行检测已经被描述【1411，这个检测方法可以在PCR运行过程中对扩增的DNA进行检测，而不是至IJPCR运行结束。一种这样的检测方法[142】被设计用来测定ORF3的保守区，在没有使用退火引物或探针的情况下也可以检测不同基因型的HEV。现在需要一种能确定HEV感染的强大、快速、高敏感、特异和准确诊断和基因分析的方法。这个方法需要追踪和跟踪HEV感染，检测食物和水污染及动物性HEV感染。为了迎合这种挑战的要求，Gyarmati等t143】发明了两种高敏感和特异的实时PCR检测方法。～种是基因TaqMa的化学方法，另外一种是基于引物．探针能量转移技术。两种方法都能快速检测不同宿主和不同基因型的HEV，都具有每个反应小于20个病毒基因组当量的敏感性。19 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析7．预防7．1水、食品和环境安全作为一种通过粪口途径传播的疾病，污染的水源或饮用水是主要的HEV感染源。历史性的水污染引起HEV流行在人类已经报道。感染猪和其他感染动物在排泄的粪便内含有大量的HEV[12】。HEV污染畜肥和排泄物，这些畜肥和排泄物随后污染灌溉和沿岸的水源从而进一步污染农作物或贝类海产品。人源和猪源HEV在污水中已经被检测到‘144】，因此妥善处理人、动物的粪便，提供安全的饮水和提高个人的卫生是预防HE的关键措施。在HE流行期间，采取措施改善水质，即便只是让水煮沸，都可以快速减少新病例的比例。在水中加氯气消毒，对于中和病毒是有用的。在印度一次HE爆发中，不断增加的HE病例与没有对水进行彻底的氯气消毒有很大的关系【521。散发性HE的发生与食用被HEV污染的生肉或没有煮熟且污染有HEV的猪肝有关【711。在日本零售店销售的猪肝有2％为猪HEVRNA阳性㈣和在美国零售店销售的猪肝有11％1721为猪HEVRNA阳性。更重要的是，在美国零售店销售污染有HEV的猪肝完全保留着HEV的感染性。对零售店销售猪肝中HEV进行测序发现，该病毒序列与少量HE病例中得到的序列是紧密相关或者完全一致的【7ll。在日本，一位53岁的老人由于食用HEV污染的野猪肉而发生了严重的HEV感染‘691。另外一位70岁的老人，由于食用相同的野猪肉发生了爆发性肝炎，最后引起了死亡【691。这两个病人都未曾到HEV流行地区旅行过，但都食用未煮熟的野猪猪肝5次。在日本的两个家庭中4例HE的病例与食用未煮熟的鹿肉有关‘681，对剩余冻存的鹿肉进行检测发现鹿肉中HEV的序列与4位病人HEV的序列同源性为99．7％．100％。总之，这些数据已经充分证明了通过直接接触感染有HEV的动物或食用感染有HEV的动物肉类能够引起人感染。针对这种传播方式的预防措施，特别是煮熟猪肉和鹿肉是有用的。另外，还要加强食品加工业生产器具的卫生，以及避免食用未煮熟或生的肉类或蔬菜，因为病毒对热不稳定【145】。7．2免疫预防在实验室的条件下，抗HEV抗体显示能中和病毒及阻止攻毒试验引起的HEV感染。因此，对人或动物进行基因疫苗免疫可能是阻止HEV传播的有效方法。8．疫苗HEV疫苗所有的努力都集中在HEV病毒的衣壳蛋白(图1．2)。由于HEV病毒不能在培养的细胞内稳定、高滴度地生长，因而传统的弱毒疫苗或灭活疫苗不能实现。各种形 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析式的ORF2重组蛋白通过多种异源的表达系统正在被探索【146】。最近，正在探讨研制OI心2相关的DNA疫苗。具体可以总结如下：8．1HEV疫苗的免疫基础尽管观察到部分试验结果是不一致的，但几个试验结果已经提示重组亚单位疫苗对于预防HE是可行的。人的自然感染及通过试验用HEV感染非灵长类动物均能使血清发展成抗HEV阳性‘1471。使用HEV对先前试验感染HEV且发展成抗体阳性的动物再次攻毒不能使其引起感染，至少在攻毒后几个月内。在HE爆发期间的流行病学调查发现先前感染过HEV的人群在HE爆发期间能得到保护作用‘14引。HEV感染后出现一个持久的抗体保护性反应，但是，确切的数据仍不是很清楚。一些研究已经指出，抗HEV抗体在感染后6．12个月消失【149】一个研究已经报道，在一次HEV爆发后，有一半的人群抗HEV-IgG能够持续14年‘1501。通过对猕猴注射高滴度的免疫血清球蛋白能够有效的阻止HEV实验感染猕猴【1471。然而，用来HEV流行疫区的血浆对健康的人群进行免疫，在临床试验上没有起到保护作用，这可能与相对低剂量免疫球蛋白的使用有关11511。相似的，用嘴个4年前感染HEV现仍呈抗HEV阳性的血清来免疫猕猴，对试验攻毒HEV不能起到保护性作用【1521。尽管现在已经报道在全球至少存在4个基因型的HEV病掣931，但这些病毒仅有一个血清型【93，12羽。让人感到乐观的是任何一种基因型的抗体对其它基因型的病毒都能起到保护作用。最后，已经发现HEVORF2衣壳蛋白诱导的抗体在体外能中和HEV【153J。总之，这些发现提示了通过研制广泛的针对HEVORF2衣壳蛋白的反应性抗体，去诱导保护性免疫反应抵抗HEV的感染是可能的。然而，与自然感染相比，成功的免疫反应需要高的和长期持续的抗体滴度。8．2重组蛋白疫苗几种不同长度的重组ORF2抗原在多种表达系统中已经得到表达，这些蛋白能够诱导抗ORF2抗体反应(表1．2)。许多截短的ORF2蛋白已经被表达、纯化、和检测免疫原性和功效，但自然蛋白在HEV病毒颗粒中的大小及自然性能仍未得到确定。5个这种抗原(TrpE．C2、pE2、Pakistan56Kda、Burma62Kda和Burma50KDa)已经显示能够产生中和抗体反应(表1．2)。因此，在这里对潜在候选疫苗抗原进行讨论。8．2．1在大肠杆菌中进行的蛋白表达在大肠杆菌中表达的蛋白，仅有两个蛋白显示有希望成为疫苗的候选，其他表达的蛋白更适合用来作为诊断试剂。在这些蛋白中，第一个是TrpE．C2，该蛋白位于缅甸株21 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析表1-2HEV候选疫苗Table．1．2HEVcandidatedvaccinesHEVORF2蛋I刍221—660个氨基酸的羟基端【1541。在临床前的攻毒试验，两只猕猴免疫重组TrpE．C2蛋白，然后分别用野生型的同基因型毒株(基因型I型)或异源型毒株(基因型II型)进行攻毒，结果显示接受同源性HEV攻毒的猕猴没有表现出任何感染HEV的证据。然而，接受异源型墨西哥HEV攻毒的猕猴被感染，表现出病毒血症，病毒排泄，抗HEV抗体水平升高，但是没有发展成生化或者组织病理学证据的肝炎。另外一个候选疫苗，pE2，是通过谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达的蛋白，该蛋白包含中国株HEVORF2394．660位氨基酸。pE2蛋白纯化后从GST融合体中分离，紧接着自动形成二聚体。该二聚体所形成的蛋白能够被患有HE且阳转的血清所识别，抗该蛋白的抗体在一种免疫捕获检测中能够成功地识另JJHEV[1551。猕猴免疫pE2蛋白后表现出 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析有效的血清阳转及能够抵抗同源HEv攻毒感染，而对照组没有达到这种效果【156】；另外在大肠杆菌中表达的候选疫苗，命名为HEV239，包含HEVORF2376．606位氨基酸[1571，该疫苗蛋白为23nm粒子，在温和的变性条件下分离成二聚体，能够与HE感染急性期和阳转后的血清及HEV特异性单克隆抗体发生强烈的反应【”7】。在灵长类攻毒试验的研究中，该疫苗能够对基因型I型和Ⅳ型的感染提供保护性作用。用该疫苗免疫动物得到的血清能够在体外中和感染性的HEV。另外也报道了该疫苗对人的安全性和有效性，但最终的结果尚未公布。8．2．2在昆虫细胞中的蛋白表达在昆虫细胞内的杆状病毒产生的重组ORF2蛋白已经被大力追求作为候选疫苗。在这个系统，72kda大小的巴基斯坦HEVORF2蛋白快速地分解成63，56和53kda的蛋白。56kda形式的蛋白聚集在昆虫细胞的细胞浆内，而53kda形式的蛋白被分泌成类病毒颗粒[158】。56Kda的ORF2重组蛋白添加明矾佐剂对猴子进行免疫显示是一种有效的免疫原[1591。此外，免疫该疫苗的动物对静脉攻毒高剂量的同源或异源的HEV攻毒能起到保挣7作用【1棚。这种疫苗已经进行了进一步的临床前试验和人的临床试验【1461。一种来自缅甸HEV株，在昆虫细胞内诱导表达的62Kda的重组ORF2蛋白也已经在猴子中进行检测‘1591。2种20ugN量的明矾佐剂疫苗在猕猴进行异源性病毒攻毒的试验中表现出保护性作用。相似的，HEV缅甸株在昆虫细胞内诱导表达的ORF2蛋白能够分泌类病毒颗粒组成一种50Kda大小的蛋白【160l。这种蛋白和53Kda大小的分泌蛋白的产生是否来自昆虫细胞表达的SAR55ORF2蛋白现在尚未被测定。24nm大小的类病毒颗粒已经通过冷冻电子显微镜进行结构描述【1611，而且已经被发现当口服免疫小鼠后能够诱导系统和粘膜抗HEV反应【162】。通过对猕猴口服免疫这种没有加任何佐剂的类病毒颗粒，最近发现能够诱导系统和粘膜的抗HEV抗体反应。更多的是这些动物在接受静脉攻毒HEV后能够起到完全的保护作用【163】。结果就提示了能够发展一种口服的重组HEV疫苗。所有杆状病毒介导的ORF2蛋白已经在Sf21或Tn5昆虫细胞系内表达和纯化。一种重组杆状病毒被设计用来对印度株HEV截短的ORF2进行蛋白表达。这个蛋白包含112．660位氨基酸，其中缺失585．610位疏水区氨基酸。重组ORF2抗原在斜纹夜蛾幼虫系统得到高水平的表达，病毒注射到第四只美国夜蛾幼虫5天后发现蛋白聚集在幼虫脂肪内。重组蛋白纯化后能够达到每只幼虫O．2mg的产量【164】。使用昆虫幼虫作为蛋白表达系统的例子已经证实昆虫细胞是潜在重组蛋白表达的商业方法。 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析8．2．3在其他系统内进行的蛋白表达一种包含ORF2551．607位氨基酸的C末端乙肝表面抗原(HBsAg)，在甲醇毕赤酵母表达系统内以类病毒嵌合颗粒形式得到表达【1651。该类病毒颗粒显示能够与包含有抗HBV和HEV抗体的人血清发生反应。目前该抗原正在被探索作为一种重组HBV／HEV二价候选疫苗。最近，在其它研究中发现，包含69．660位或112．660位氨基酸的抗原在毕赤酵母表达系统内均能独立的表达，纯化的蛋白已经显示在猕猴能够诱导高水平抗体‘166】。早期在大肠杆菌表达系统内表达的23Kda大小的ORF2抗原(pE2，包含394．604位氨基酸)[155】，最近在转基因番茄植物内被表达。但在该系统内的表达量相当的低，每克叶子或水果组织仅含有40．60ng蛋白t1671。8．3DNA疫苗直接注射DNA质粒已经显示能够在细胞内合成病毒抗原，也能诱导体液或细胞免疫反应。用HEVORF2表达蛋白构建的疫苗直接对老鼠进行免疫，结果显示能够产生抗HEV抗体‘1681和免疫记忆。这些免疫反应通过调节白细胞介素2和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子能够得到增强【1691。在临床前效率试验中发现，当使用基因枪的方法对猕猴免疫ORF2表达的蛋白时，猕猴在其后的病毒攻毒试验中得到保护作用，而使用皮内注射的方法时没有达到这种效果【1701。DNA加重组蛋白，最近在在小鼠内显示能够产生免疫原性‘17们，这个试验利用了DNA和重组蛋白共同展示HEVORF2中和表位。一种基于注射携带DNA疫苗和重组抗原脂质体的方法在猕猴攻毒试验中也被报道能够提供保护作用。尽管DNA疫苗在稳定性和制备方面具有明显的进步，但在传递模式和免疫反应特征方面仍有许多研究需要迸一步探讨。8．4临床试验在人方面，临床前疫苗的免疫原性和效率仅在数量有限的HEV候选疫苗中被研究。在这些疫苗中仅仅有一种疫苗至今能够进行人群临床试验。马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院研究了杆状病毒表达系统表达的56Kda大小的ORF2蛋白，并授权给GlaxoSmithKline。该蛋白在人方面的免疫效果在沃尔特里德军队医学科学研究所(华盛顿特区)进行评估【H61。用该蛋白免疫猕猴后紧接着用三种不同基因型的HEV进行攻毒，结果显示出高的免疫原性和有效保护猕猴受病毒感染【17¨。第一试验阶段，在美国和尼泊尔健康的志愿受验者中，疫苗表现出安全且具有免疫原性【1461。免疫试验共设计了1烬，599，2099或401．tg3个剂量重组蛋白的免疫计划，免疫效果随着蛋白剂量的增加能产生更好的抗体滴度。三个剂量，每个40腭(大约75个世卫组织单位／毫升)，可以唤起免疫记忆【1721。24 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析最近，疫苗第二和第三阶段的效率试验在尼泊尔进行，试验结果已经被公布【1731。这个研究包括2000个来自尼泊尔检测为抗HEV抗体阴性的军队志愿者，他们随机接受2099明矾佐剂重组HEV蛋白或者匹配的对照试剂，每位志愿者在0，1，6月分别进行T3次免疫，随后在攻毒后的两年内进行跟踪调查。在全部受验者中，88％的比例能够完成试验，共持续了804天。那些接受了三次剂量免疫的受验者，临床上发生急性感染的数量明显比接受匹配对照试剂的受验者低，疫苗效率达到95％。与匹配试剂相比除了注射部位出现疼痛外，没有明显的区别。然而，这个研究存在着部分限制，首先，这个研究的对象大部分是男性(>99％)且均很年轻(平均年龄25岁)；第二，作者没有研究HEV的感染率，而是着重于临床疾病的发生率；最后，在试验的末期，抗体滴度下降非常的严重，仅有44％的人群达到理想保护性抗体滴度。8．5疫苗研究展望根据最近公布的临床前治疗数据和临床试验结果，基于HEVORF2蛋白研制的疫苗显示能够起到保护性作用，防止HE综合症的发生。尽管这些结果很让人鼓舞，但是仍翟有几个问题需要解决。第一，疫苗的免疫力能维持多久?当出现自然感染后能否通过疫苗免疫来提供长期的免疫力。第二，是否疫苗仅仅对症状疾病或HEV感染提供保护力仍需要进一步研究。第三，对于暴露后预防，疫苗是否有效?现在仍不是很清楚。疫苗是否能被用来控制HEV的爆发非常重要，特别是在人群已经与感染性HEV接触的情况下。9．研究的目的和意义国外文献己报道多起由于食用未煮熟的猪肉或猪肝而受感染发病或死亡的病例。现大量的研究己证实，HE是一种人畜共患传染病。HEV除感染人和猪外，还能感染多种动物如鸡、牛、羊、鼠、犬、马、鹿等，并共同组成HEV的巨大病毒储存库，协同促进HE的感染、传播以及为HEV的变异进化提供了充分的遗传信息资源。HE无论对养殖业还是对人类的健康与生命安全都造成了很大的威胁。目前，HE已被世界卫生组织(WHO)认为是发展中国家的一个重要公共卫生问题。HEV在国外进行了大量的调查和研究，国内的其它省份也进行了较系统的调查，但在广西全面的调查尚未展开，因此弄清广西猪戊型肝炎的流行状况、猪源HEV与人源HEV在基因水平上的差异具有重大的意义。由于HEV缺乏有效的细胞培养系统，大量培养高滴度的HEV来生产常规疫苗存在 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析较大难度，目前还未研发出商用常规疫苗。在HE分子病原学研究基础上，研究HEV抗原表位的分布及抗原性基因的特征，筛选克隆抗原性基因进行构建基因工程疫苗是一个研究方向，可为HE的免疫预防提供新型候选疫苗。本研究通过RT．nested．PCR方法，对广西不同地区猪群HEV感染率、HEV在不同年龄猪群的感染情况及HEV基因型特征进行调查分析。另外，扩增广西猪HEVORF2部分基因，并对其抗原性进行分析，为HE防治措施的制定、ELISA诊断试剂及基因工程疫苗研制提供理论基础。 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析第二部分试验研究一广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及基因型分析1．材料与方法1．1材料1．1．1样品2009年07月-2010年03月从广西6个市县13个不同规模猪场采集的135份新鲜猪粪。1．1．2菌种E．eoliDH5a，由本实验室保存。1．1．3引物参考Genbank上四种基因型HEV核苷酸序列，应用生物软件Oli906．0在ORF2保守区设计了两对兼并引物，外套引物为：HEV-A／B，内套引物为：HEV-C／D，扩增片段位于中国T1株5988bp_—6384bp之间，长为436bp。引物序列：HEV二ATAYCGHAAYCAAGGHTGGCG，HEV-BTGYTGGTTRTCRTARTCCTGHEV二CACYTCHGGBGTBGCKGAGGA，HEV-DGCTCGCCATTGGCTGAGAC1．1．4试剂TaqDNA聚合酶、内切酶HindlII和BamHI：Fermentas公司产品；Rnasin抑制剂、pMDl8．T克隆载体：大连宝生物工程有限公司产品；TrizolRNA抽提试剂、dNTP、胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、琼脂糖粉：上海生工生物工程公司产品；反转录酶：Promega公司产品；EB替代染料：北京普利莱基因技术有限公司产品；氯仿：天津市北方天医化学试剂厂产品；异丙醇：天津市博迪化工有限公司产品；无水乙醇：广东汕头市西陇化工厂产品。1．1．5试剂的配制1．1．5．1引物稀释加入适量无Rnasin水，使引物稀释成25pmol／I．tl，移液器反复吹匀，分装后-20。C冻存备用。1．1．5．2感受态细胞试剂配制 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析A、100mMol／LCaCl2的配制：CaCl21．119蒸馏水100IIll溶解混匀后，121℃(15磅)高压灭菌15min，冷却后4℃存放。B、100mMol／LMgCl2的配制：MgCl2．6H202．0339蒸馏水100“溶解混匀后，121℃(15磅)高压灭菌15min，冷却后4℃存放。C、甘油溶液的配制：100mMol／LCaCl225．8ml甘油4．2mi混匀后，121℃(15磅)高压灭菌15min，冷却后4℃存放。1．1．5．3培养基的配制A、LB培养基的配制：NaCl10．0g酵母提取物5．09．胰蛋白胨10．0g加1000ml去离子水，调pH至7．0，121℃(15磅)高压灭菌15min。B、LA培养基的制备：在LB培养基中加入营养琼脂粉，使之浓度达到1．5．2％。121℃(15磅)高压灭菌15min，等培养基温度降至60℃左右，倒入高压灭菌的平皿，每个平皿15．20ml。1．1．6主要仪器手提式蒸汽灭菌压力锅：江阴滨江医疗设备有限公司产品；电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂产品；水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司产品；离心机：Eppendoff公司产品；电泳凝胶图像分析系统：上海天能科技有限公司产品；超低温冰箱、制冷运动摇床：ThenIloForma公司产品；电泳仪：北京市六一仪器厂产品；梯度PCR仪：美国Bio．rad公司产品；超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司产品；旋涡混合器：江苏麒麟医用仪器厂产品。1．2方法1．2．1粪便样品的处理 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析挑取0．49新鲜猪粪样品于5ml离心管内，加入4ml灭菌PBS(O．01M，PH7．2)进行稀释，旋涡震荡混匀，制备成10％的粪便悬液，4。C，10000rpm离心10min，抽取上清进行RNA抽提或．70。C保存。1．2．2粪便中病毒RNA的提取(1)取粪便样品上清液250I_tL于1．5ml的EP管中(DEPC水处理，高压灭菌)，加入800肛1Trizol，反复颠倒数次充分混匀后，室温放置10min。(2)加入2109l氯仿，反复颠倒数次充分混匀(成乳白色为止)，室温下放置3min。(3)4。C，12000rpm离心10min后，小心取3509l上层液体，转移到一个新的EP管，再加入等量预冷异丙醇(350I-t1)，温和混匀，室温下放置10min。(4)4。C，12000rpm离心10min后，弃去上清，加入5001al75％预冷酒精，温和混匀，8000rpm离心5min。(5)将抽提RNA置50。C温箱内晾干(管壁上水滴消失即可)后，加入359l无RNase的水，用移液器反复温和吹匀，并于50℃水浴5min至RNA充分溶解。‘甓(6)即用或一70℃保存备用。1．2．3反转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)1．2．3．1反转录(I玎)取169L充分溶解的RNA于2001alEP管内，其后分别加入：外套下游引物(HEV-B)1“l反转录酶5xbuffer5lxldNTP2p．1RnasinInhibitor(抑制剂)0．59lM-MuLVReverseTranscriptase(反转录酶)0．5p,1各试剂混匀后，置低速离心机内5000rpm离心数秒，使管壁内液体离至管底，然后置水浴锅或PCR仪中42℃反转录1h，反转录产物立即进行PCR或一20℃保存备用。1．2．3．2PCR25／al反应体系：无菌H2016．75p,1MgCl22．09l10×PCRBuffer2．59l 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析正向引物(HEV-A或HEV-C)反向引物(HEV-B或HEV．D)dNTPTaqDNA聚合酶cDNA(I玎产物)第一和第二轮反应程序均为：095"C5min0．5“l0．5plO．51xl0．25I．tl3m②95℃50min；53。C50min；72。CImin；共35个循环③72℃10min1．2．3．3电泳1．2．3．3．1制胶(1)称取O．59琼脂糖粉于250ml的锥形瓶，加50ml凝胶溶液混匀，置微波炉内煮沸，至琼脂粉颗粒完全溶解为止。‘(2)待凝胶溶液温度降至60。C时，加入2¨lEB替代染料混匀，倒入制胶容器，待凝胶冷却凝固。1．2．3．3．2电泳在制备好的琼脂糖凝胶孔内加入lOI．tlPCR产物，120V电泳至条带跑开后，在电泳图像分析仪上观察结果。1．2．4胶回收1．2．4．1电泳(1)取PCR产物201xL加到已做好的琼脂糖凝胶加样孔中。(2)电泳至Marker最后一条带跑至胶体的2／3处，即停止电泳。1．2．4．2凝胶中DNA的回收操作按照上海生工生物工程公司胶回收试剂盒说明操作。步骤如下：(1)用手术刀割下含DNA的琼脂块，放入1．5m1离心管中。(2)称量凝胶的重量，以lmg=lp．1换算凝胶的体积。(3)按照凝胶浓度，按下表提供的参数加入相应比例的BindingBufferII凝胶浓度BindingBufferII小于或等于1％3个胶体积 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析小于或等于1．5％小于或等于2％大于2％4个胶体积5个胶体积6个胶体积(4)置于50,--,60。C水浴10min，使胶彻底融化。加热胶时，每2min混匀一次。(5)将融化的胶溶液转移到套放在2mL收集管内的UNIQ．10柱中，室温放置2min，12000rpm室温离心lmin。(6)取下UNIQ一10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ一10柱放回同一收集管中，加入500“Lwashsolution，12000rpm室温离心1min。(7)重复步骤6一次。(8)取下UNIQ．10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放回同一收集管中，12000rpm室温离心2min除去残留的液体。(9)将UNIQ一10柱放入一个新的1．5mL离心管中(50℃温育5分钟彻底除掉残留的液体)，在柱子膜中央加入40此ElutionBuffer(使用前加热到60．70℃)，放置5min。(10)12000rpm室温离心lmin，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或．20℃保存备用。1．2．5感受态细胞的制备(1)取出DH5a菌种，平板划线培养，37。C恒温过夜。(2)挑平板上单个DH5a菌落接种于4mLLB培养液中，200rmp37"C恒温振荡过夜。(3)取培养好的菌液2mL于lOOmL的LB培养液中(200ml的玻璃瓶)，200rmp，37。C恒温振荡培养菌液OD值至0．6—1．0之间(约2．5小时)。(4)分装到已灭菌好的25mL离心管中(20mL／管)，冰浴5min，3000rpm离心3min沉淀细菌，倒掉上清。(5)用冰浴制冷的100mMol／LMgCl2lOmL重悬细菌(振荡器振荡或移液器吹匀)，3000rpm离心3min沉淀细菌，倒掉上清。(6)用冰浴制冷的100mMol／LCaCl210mL重悬细菌，冰浴20min，3000rpm离心3min沉淀细胞，倒掉上清。(7)用冰浴制冷的甘油溶液2,0mL重悬细菌，分装到1．5mL的EP管中，每管100肛1。(8)将制备好的感受态细胞置4"C过夜后，第二天可直接使用或一70。C冻存备用。1．2．6基因克隆1．2．6．1目的基因的连接 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析将纯化的产物(胶回收产物)与克隆载体pMDl8．T连接，10Ltl连接体系为：PMD18一TVector(50ng／lal)lp,1胶回收PCR产物41xlLigationSolutionI5lxl各样品或试剂混匀后于160C连接过夜，第二天直接用于转化。1．2．6．2转化(1)于．70。C取出冻存的感受态细胞，冰浴10min至溶解。取连接产物10此放入感受态细胞中，移液器轻轻吹打以混匀内容物，冰浴30min。(2)42*(2热休克120s(不能摇动Ep管)后，冰浴5min，然后加入LB培养基800I-tl，200rpm，37℃恒温振荡培养2h。(3)将150ul菌液与501xL10mg／mLAmp+于1．5ml的EP管内混匀。用无菌铺菌器铺于无抗生素的LA平板。37"C正放Ih，至菌液与培养基附着，不形成流动水滴为止，然后倒置培养16．20h。(4)将疑似阳性克隆的菌落，接种到4mL含50p,L10mg／mLAmp+的LB培养基中，37*(2培养12h后，直接用于质粒的抽提或4"C保存。1．2．6．3抽提质粒操作按照上海生工生物工程公司质粒抽提试剂盒说明操作。步骤如下：(1)将过夜培养的l一2mL细菌12000rpm室温离心15s，彻底去除上清。(2)加入250p,LsolutionI，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。(3)加入250pLsolutionII，立即温和混匀，使细菌裂解，室温放置2min。(4)DI,X．350pLsolutionIII，立即上下颠倒5—10次，室温放置5min。12000rpm离心10min。(5)将步骤5中上清转移到套放在2mL收集管内的UNIQ．10柱中(避免吸到沉淀的蛋白)，室温放置2min，8000rpm室温离心30s。(6)倒掉收集管中的废液，将UNIQ．10柱放入同一收集管中，加入500}tLwashsolution到UNIQ．10柱中，10000rpm室温离心1min。(7)重复步骤(6)。(8)倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，12000rpm室温离心2rain，以彻底除去washsolution。离心后将UNIQ．10柱放入恒温箱中55。C干燥5min。(9)将UNIQ．10柱放入一根新的1．5mL离心管中，在柱子膜中央加入40}tLElutionBuffer，室温放置2min，10000rpm室温离心1min。离心管中的液体即为所抽提的质粒32 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析DNA。1．2．6．4重组质粒酶切及PCR鉴定1．2．6．4．1重组质粒酶切鉴定取上述抽提的质粒进行酶切鉴定，酶切体系为：ddH204．4pLTangobuffer1．0pLHind1110．3pLBamH10．3pL质粒4．0pL总体积10pL37℃水浴酶切3．4小时。1．2．6．4．2重组质粒PCR鉴定取2pL抽提的质粒或菌液替代RT产物(CDNA)作为模板，其它试剂和用量及PCR譬反应程序与1．2．3．2中PCR相同。制备1．0％的琼脂糖凝胶(含EB替代染料)，取10p,L酶切产物或PCR产物，在120V电压，25mA电流电泳30min，在成像分析仪上观察电泳结果。1．2．7基因测序取酶切和PCR鉴定为阳性克隆的质粒或菌液送上海生工生物工程公司测序。1．2．8序列比对运用DNAstar软件中的MegAlign，对扩增的基因片段序列(去除引物序列)与Genbank上各基因型参考序列进行核苷酸和氨基酸同源性比对。参考序列：HEV基因型I型：HeBei(M94177)、hev037(X98292)、HEVNE8L(D10330)、Madras(X99441)、Morocco(AY230202)、SAR一55(M80581)、Uighl79(D11093)、Xinjian91986(D11092)基因型II型：M(M74506)基因型III型：Arkell(AYll5488)、JKN-Sap(AB074918)、JRAl(AP003430)、SAAS—JDY5(FJ527832)、swUSl(AF082843)、USl(AF060668)、US2(AF060669)基因型Ⅳ型：CCC220(ABl08537)、Ch—S一1(EF077630)、Ch．S一1(EF077630)、HE—Jl(AB082545)、HE-JK4(AB099347)、HE-JAl(AB097812)、HE—JA2(AB082558)、HE-JVN1(AB168096)、JAK-Sai(AB074915)、JSM—Sap95(AB161717)、33 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析JSN．SAP．FH02C(AB200239)、swCH31(DQ450072)、swCH25(AY594199)、swDQ(DQ279091)、swGX32(EU366959)、swGX40(EU676172)、swJ7—5(AB094223)、swJl3-1(AB097811)、swSB66(ABl24818)、Tl(AJ272108)、T1I(AFl51962)禽HEV：AvianHEV(AY535004)1．2．9进化树构建进化树构建之前将测定序列中引物部分去除，最后用于进化树构建的序列为397bp。使用CLUSTAL．W1．83(ftp：／／ftpigbmc．U．stras／pub／clustalX)对测定的序列和Genbank上参考的序列进行比对，使用MEGA4．1软件(http：／／㈣Megasoftware．net)进行进化树构建，1000个样品重复用来计算分支的百分比。参考序列分离株及Genbank登录号、国家、物种来源见图2．1／2。另外，为了能更充分的反映分离株与国内基因型Ⅳ型进化关系，本研究取部分扩增片段(300bp，位于T1株6029-----6328bp)与更多的参考序列进一步进行进化树分析。基因型Ⅳ型300bp参考序列：LZ-105(ARl03940)、Chl08(AJ344181)、Chl94(AJ344191)、。G8(AJ428854)、swChl1(AY596320)、swCH19(AY621096)、swSJ14(AJ428856)、G6(AJ428853)，见图2．3／4。2．结果2．1广西猪戊型肝炎流行情况共检测了广西6个市县13个不同猪场猪群，仅1个猪场未检测到HEVRNA，猪场阳性率为92．3％。各猪场检出率在0硝．4％之间，且13个猪场中有8个猪场感染率在30．45％之间。共检测粪便样品135份，38份为HEVRNA阳性，阳性率为28．1％(表2-1)。表2．1广西各地猪场HEV病料的来源及检测结果Table．2一lOriginsofGuangxiHEVfecalsamplesandresults 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析2．2猪群不同年龄感染率调查对13个猪场中各种年龄样品均能采集到的6个猪场猪群进行感染率调查，结果显示67份不同月龄的样品中，0．30日龄的9份样品均为HEVRNA阴性。31．60日龄的13份样品仅l份为HEVRNA阳性，阳性率为7．7％；61．90日龄的15份样品中6份样品为HEVRNA阳性，阳性率为40％；91．120日龄的17份样品中，10份为HEVRNA阳性，阳性率最高，为58．8％；当猪群年龄超过120日龄后HEVRNA阳性率逐渐降低，13份样品中有4份为阳性样品，阳性率为30．8％。结果显示2．4月龄为猪群的感染高峰期，32份样品中有16份样品为HEVRNA阳性，阳性率为50％(表2．2、图2．1)。表2-2猪群不同日龄感染率Table．2-2Infectionrateofpigsofdifferentages猪场／感染率0．30天31．60天61．90天91—120天>121天Pigfarm／infection0-30day31-60day61-90day91—120day>121day 广西大学硕七学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊理肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析阳性数／检测阳性数／检测样阳性数，检测阳性数／检测阳性数／检测样品数品数样品数Positivesamples／detecsamples／detectesamples／detecsamplesJdetectedsamplesdsamplestedsamplestedsamplestedsamples图2．1不同月龄猪HEVRNA阳性率的比较Fig．2-lComparisonofHEVRNAinpigsofdifferentageranges2．320株分离株之间及与参考株同源性比较2．3．1分离株核苷酸同源性比较随机对24份阳性样品进行克隆，去除4份同源性为100％的分离株后得到20株同源性不一致的序列。20株分离株间核苷酸同源性为91．2．99．7％，在20株分离株中，部分来源于同一个猪场但同源性并未达到很高，如swWM．a-1与swWM．a-2同源性为92．9％，swHX．3与swHX-I同源性为93．5％，swWM．b-2与swWM．b-3同源性为94．2％。2．3．2与参考株核苷酸同源性比较 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析与基因型I型、II型、IⅡ型、Ⅳ型及禽HEV参考株核苷酸同源性分别为：78．6—83．4％，75．9．77．9％，75．3．81．4％，83．4．97．7％；55．6．58．9％。其中，分离株与参考株HE．JVNl(ABl68096)、swGX40(EU676172)、swDQ(DQ279091)源性较高，分别为：94．0．97．7％，93．7．97．7％，91．2．94．7％。分离株与参考株swGX32(EU366959)同源性最低，为83．4．87．2％。2．3．3分离株间氨基酸同源性比较20株分离株间氨基酸同源性为97．7．100％，其中13株氨基酸同源性为100％，分别为swBL．2、swGP．1、swHX一2、swHX-3、swNN—C一1、swNN—C-2、swNN-a-1、swWM-a-3、swWM．a-4、swWM．a-2、swWM．b．2、SWWM．b．3、swBB．b．1。2．3．4与参考株氨基酸同源性比较与基因型I型、II型、III型、Ⅳ型及禽HEV参考株氨基酸同源性分别为：92．4．95．5％、93．1．93．9％、94．7．97％、97．7．100％、55．6—56．5％。2．4遗传进化树分析2．4．1基于397bp构建的进化树通过用MEGA4．1软件Neighbor-Joining中的P一距离法对本研究的20株分离株与各基因型参考株构建进化树，进化树见图2-2／3，其中图2．2为传统的进化树图，图2-3为辐射进化树图。所有的分离株均属于基因型Ⅳ型。根据Lu等【421的分型标准，所有基因型Ⅳ型可以分为6个亚型，分别为亚型a、b、C、d、e、f，本研究20株分离株都分布在亚型b中。分离株与三株猪源参考株swGX40、swDQ、swSB66和一株人源参考株HE—JVNl亲缘关系最近，同属于亚型b。在所有Ⅳ型参考序列中与LI等【1741获得的广西本地分离株swGX32亲缘关系最远。20株毒株可以分为两支大的分支，其中SwHX．b．3、swWM—b一2、swNN．b—l、swWM．a-1处于同一分支(第一分支)，其它的分离株处于另外一个分支(第二分支)，在第二分支内又可以分为若干的亚分支。2．4．2基于300bp构建的进化树300bp构建的进化树与397bp构建的进化树大致相同，不同之处在于：亚型b中增添了猪源参考株swSJl4和人源参考株LZ．105，其中LZ一105为广西本地株(图2-4／5)。 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORT2的扩增和抗原性分析Xinjian91986(D11092)1ChinalHumanArkell(AYl15488)lCanadalSwineSAAS-JDY5(FJ527832)IChinalSwineJRAlfAP003430)lJapanlHumanUS2(AF060669)／USA／HumanJKN-Sap(AB074918)／Japan／HumanswUSlfAF082843)IUSA／SwineUSlfAF060668)IUSA／HumanAvianHEV(AY535004)／USlchicken图2—2基于397bp构建的进化树(传统进化树)Fig．2-2phylogenetictreebased011397bp(Traditionalphylogenetictree)38基因型III禽舰V 广西大学硕十学位论文广两猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析禽HEV基因型Ⅲ图2—3基于397bp构建的进化树(辐射进化树)Fig．2-3Phylogenetictreebasedon397bp(Radiationphyiogenetictree)基因型Ⅱ图2-2／3基于397bp构建的进化树。使用gega4．1软件对核苷酸序列进行配对比较，P一距离显示核苷酸的绝对差异。使用邻接法中的P一距离对已排除引物序列的分离株及Genbank上参考的序列进行进化树构建，Bootstrap检验方法进行检验。毒株的来源、国家在进化树中注明。使用禽HEV作为外群对照。分离株用实心菱形标注。Fig．2-2／3Constructionofthephylogenetictreebasedon397bp．NucleotidesequencesusingMeg“．1softwaretopairedcomparison,P-distanceshowtheabsolutedifferencesbeh嗍lthenucleotides．UsingP-distanceofneighborjoiningtoconslruetephylogenetictree．Bootswaptestmethodfortesting．SourcesofswainandCountriesindicatedinthephylogenetictree．AvianHEVasalloutgroupcontr01．Isolatesmarkedwithasoliddiamond．3zm《一>‘au伪。譬《c抽p若了一。万●， 基因型Ⅳ卜Ⅱ图2-4基于300bp构建的进化树(传统进化树)Fig．2-4Phylogenetictreebasedon300bp(Traditionalphylogenetictree)禽HEV型亚]IIIIlIIlllIIIlIIlIl_]一型亚]]IIIJ]l_]]III_]ⅡI型因基一、●●●L厂●j 广西大学硕十学位论文广两猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析基因型Ⅳ禽HEV≥孚罱{叠基宝荟等导；：基因型I图2-5基于300bp构建的进化树(辐射进化树)Fig．2·5Phylogenetictreebased011300bp(Radiationphylogenetictree)基因型Ⅲ图2-4／5基于300bp构建的进化树。使用Mega4．1软件对核苷酸序列进行配对比较，P一距离显示核苷酸的绝对差异。使用邻接法中的P一距离对已排除引物序列的分离株及Genbank上参考的序列进行进化树构建，Bootstrap检验方法进行检验。毒株的来源、国家在在进化树中注明。使用禽HEV作为外群对照。分离株用实心菱形标注．Fig．2-415Consmlctionofthephylogenetictreebasedon300bp．NucleofdesequencesusingMcga4．1softwaretopaired∞mparison,P-distan∞showtheabsolutedifferencesbdc’jVeenthenucicotidcs．UsingP-distanc圮ofneighborjoiningtoconstructphylogenetictree．B毗traptestmethodfortesting．SourcesofswainandCountriesindicatedinthephylogenetictree．AvianHEV嬲alloutgroupcontr01．Isolatesmarkedwithasoliddiamond．41 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析3．讨论JI等【12l】通过RT-PCR方法对广西农村地区120份猪粪样品进行检测．结果显示29份为阳性，阳性率达到24％。本研究对广西不同地区135份各种年龄猪粪进行RT．nested．PCR检测，结果显示29．6％的猪群为HEVI矾A阳性，暗示了广西猪群普遍流行HEV的感染。另外，YANLIJI使用获得的广西本地swGX40、swGX32阳性猪粪用于试验攻毒猕猴，结果发现能使猕猴引起感染，提示了广西本地猪源HEV具有种间传播的能力。现大量的数据已经证实HEV的传播不仅可以通过水源性污染引起感染【8，9'531，也可以通过食源性污染引起感染。美[]Feagins等对127份市售猪肝脏进行检测，有14份HEVRNA呈阳性，动物实验表明这些病毒具有感染性【721。最近研究发现日本北海道HE临床病例非常盛行，且与食源性污染有很大关系‘71，1751。另外，也有报道食用野鹿肉或野猪肉引起HEV感染的病例‘68，69,1761。因此，在HEV感染非常普遍的广西要做好预防HE的措施。大量的研究已经证实HEV分布存在一定的地域性，不同地区间HEV毒株核苷酸同源性存在一定的差异，同一个地区的分离株核苷酸同源性往往比较接近【42，"7】。对20株分离株进行核苷酸同源性比较发现，分离株间同源性为91．2．99．7％，普遍高于国内外其它地区的毒株，但有趣的是参考株swGX32为广西本地的分离株，但与本研究的20株分离株及以往广西的分离株同源性均较低，仅为83．4．87．2％，这种现象的出现可能与广西本地猪场从其它地区或国外引种有关。该时间段(2009年07月．2010年03月)的调查显示，广西猪群的感染率为28．1％，比该研究于2008年11月．2009年4调查的结果(阳性率44．6％)明显要低。最本质的原因是前期调查采集的样品主要集中于3月龄左右，而该时间段采集的材料分别处在猪群不同的年龄。Santos等1100j报道显示，猪群感染集中在ll周到20周之间，大概是2月至4月龄左右。因此，本次研究结果偏低是合理的。另外，本研究在2．4月龄HEVRNA检出率为50％，与Santos的发现相似；仔猪出生吸吮初乳后能快速的获得母源抗体，且抗体能维持8．11周，因此在2月龄内仔猪能得到母源抗体的保护，感染率非常的低，本研究发现2月龄内猪群感染率为7．7％，与Santos的结论相一致；Santos还报道了20周龄后猪群抗HEV抗体逐渐上升，HEVRNA检出率逐渐减少。本研究在4月龄猪群HEVRNA检测为30．8％，明显低于2-4月龄(50％)，进一步支持了这个观点。20株分离株之间核苷酸同源性为91．2．99．7％，分离株除了与Ⅳ型同源性相对较高外，与基因型I、II、ⅡI型的同源性均小于84％，但相反的是分离株与基因型I、II、IⅡ、42 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析Ⅳ型(哺乳动物HEV基因型)的氨基酸同源性均高于92％，且在20株分离株中有13株氨基酸同源性为100％，说明了HEV的突变大部分为沉默突变，如此高的氨基酸同源性也从侧面进一步说明了HEV在哺乳动物仅为一个血清型凹】。HE为世界性传染病，现已确定HEV基因型Ⅳ型在猪群和人群中均能引起感染。以往的调查发现，广西常发生的散发性病例是由基因型I型引起【lll】，但近年来“等【113】对中国南方农村地区调查发现起主导作用的基因型为Ⅳ型。YANLI等【1211对中国广西柳州猪群粪进行检测及进化树分析，结果显示15株分离株也均属于基因型Ⅳ型。进化树显示本研究从猪粪分离到的毒株均为Ⅳ型，从而进一步支持基因型Ⅳ型为该地区人畜盛行的基因型。另外，YANLIJI还对分离到的15株毒株进行亚型划分，15株分离株共同构成以swGX40(EUl58067)和swGX32(EUl58066)为代表株的两个亚型。15株分离株中以swGX40为代表的毒株占据13株，以swGX32为代表的毒株占据2株。Li等在中国南方乡村检测了24例散发急性病例，结果发现23例与swGx40处于同一个亚型【1131。根据Lu’S142】的分型方法(按HEVORF25’端或3’端核苷酸突变率达到12．6～19．8％或12．9．-．-19．3％划分为一个亚型)，本研究的分离株(397bp)和Ⅳ型参考序列在构建进化树中，可以分为6个亚型，分别为亚型a、b、c、d、e、f。该分型与YANLIJI参考zhai’s【1781分型方法得到的结果是一致的。所有分离株与先前分离到的广西本地分离株swGX40同源性最高，属于同一个亚型，b亚型。但未发现任何一株与广西本地株swGX32属于同一亚型，从而暗示了在广西猪群中循环的HEV毒株以亚型b为优势毒株，s、ⅣGX32为代表的毒株有减少或消失的趋势。基于300bp构建的进化树，分离株除了与swGX40、HE．JVNl、swDQ的进化关系较近外，还与swSJl4、LZ．105进化关系较近。与swSJl4核苷酸同源性为92．0．95．7％与LZ．105的核苷酸同源性为92．O．94．3％。在6株参考株中，LZ．105为广西本地人源HEV，分离株和人源LZ．105株高同源性支持THEV为人畜共患病的假设【106，1761。HE．JVNl分离株是从到越南旅游食用未煮熟的贝类海产品感染HEV的日本旅游者中得到【"91。广西与越南相邻，该发现也表明了亚型b为该区域人和猪流行性HE的主要致病因素；另外，参考株swDQ为中国东北分离株，swSJl4来自中国东部，进而提示了亚型b在中国分布非常广，中国南方为主要流行区域，其它区域为散发性发生。从397bp或300bp构建的遗传进化树上可以看到，分离到的20株毒株可以分为两支大的分支，其中SwHX．b．3、swWM．b．2、swNN．b一1、swWM．a-1处于一个分支外(第一分支)，其它的分离株处于另外一个分支(第二分支)，在第二分支内又可以分为若干43 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行痈箩塑查垦堡型旺壅堕童旦堕!箜芏塑塑堕堕!!坌堑亚分支，说明广西猪HEV存在较大的变异。有趣的是来源于同一个猪场分离到的HEV同源性并非很高，swWM．a-1与swWM．a-2同源性为92．9％，swHX一3与swHX·1同源性为93．5％，swWM．b。2与swWM．b．3同源性为94．2％。它们都分别处在不同的分支，该种现象的出现可能是由于引种的原因或是HEV在猪群内长期进化的结果。 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析二猪戊型肝炎病毒ORF2的扩增及抗原性分析1．材料与方法1．1材料1．1．1试验材料新鲜猪粪便、经北京万泰HEVELISA诊断试剂盒诊断为阳性的自然感染猪血清：采集于广西某猪场；北京万泰HEVELISA诊断试剂盒阳性对照血清。克隆宿主菌E．coliDH5a、表达宿主菌BL21(DE3)pLysS、pET32a(+)载体：本实验室保存。1．1．2试剂反转录酶：Promega公司产品；抑制剂、PMDl8T载体：大连宝生物工程有限公司产品；TaqDNA聚合酶、T4连接酶、HindlII和BamHI内切酶、蛋白质分子质量标准：Fermentas公司产品；IPTG、溴酚蓝、p．巯基乙醇：上海生工生物工程公司产品；HRP标记的兔抗猪IgG．-北京博奥森生物技术有限公司产品；HRP-DAB底物显色试剂盒：天根生化科技有限公司产品；脱脂奶粉、PVDF膜、Tris、过硫酸铵：Solarbio公司产品；丙烯酰胺(Acr)、N，N．双甲基丙烯酰胺(Bis)：BBI公司产品；SDS：Wolsen公司产品；甲醇、醋酸、盐酸：成都市科龙化工试剂厂产品；3MM滤纸：美国Bio．rad公司产品；考马斯亮兰R250：Serva公司产品。1．1．3各种试验材料和试剂的配制1．1．3．1感受态细胞BL21(ED3)PlysS的配制：制备方法与研究二1．2．5制备方法相同。1．1．3．2细菌培养基的配制：LB培养基、LA固体培养基制备方法同研究二中1．1．5．3制备方法相同1．1．3．3SDS．PAGE试剂的的配制(1)丙烯酰胺-N，N双甲基丙烯酰胺(30％Acr-Bis)贮存液：N，N一双甲基丙烯酰胺(Bis)29，丙烯酰胺(Acr)589，加蒸馏水至200ml，完全溶解后通过滤纸过滤除去不溶物。4℃避光保存。(2)0．5mol"Iris．HCI：嘶s69，加蒸馏水至100ml，用浓HCI调pH至6．8，4"C保存。(3)1．5molTris．HCI："Iris54．59，加蒸馏水至300ml，用浓HCI调pH至8．8，4"C保存。(4)10％APS(过硫酸铵)：APS0．59，加蒸馏水至5ml，40C避光保存。(5)10％SDS(十二烷基磺酸钠)：lOgSDS在68"C))1热条件下溶于一定量蒸馏水，完全溶解45 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析后加蒸馏水至100ml，室温保存。(6)2x样品缓冲液：甘油2．5ml，0．5M"Iris—HCI(pH6．8)1．25ml，10％SDS2．0ml，O．5％溴酚蓝0．2ml，加3．55ml蒸馏水，总体积9．5ml，室温保存。(7)10倍电泳缓冲液：Tris30．39，甘氨酸1449，SDS109，加蒸馏水至1000ml，室温保存。(8)染色液：甲醇500ml，考马斯亮兰RE502．59，醋酸50ml，加450ml蒸馏水，总体积1000ml，室温保存。1．1．3．4Western．Blot试剂的的配制(1)封闭液：59脱脂奶粉溶解于100mlTBS溶液中。(2)一抗溶液：用封闭液与HEV自然感染猪阳性血清混匀，稀释成40：1的比例；二抗溶液：用封闭液与辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG酶标抗体混匀，稀释成1000：1的比例。(3)10×浓缩平衡液：嘣s甘氨酸水7．59369220ml调PH至8．3，使用前将其稀释成l倍，且加入15％的甲醇。(4)10xTBS缓冲液：Nacl87．669Tris12．119加1000ml双蒸水，充分溶解混匀后，用HCl调PH值至7．5。(5)TTBS缓冲液：将10xTBS缓冲液稀释成1xTBS，加入Tween-20，使其浓度达到O．1％。1．1．4主要仪器设备制冷运动摇床：ThermoForma公司产品；梯度PCR仪：美国Bio—rad公司产品；离心机：Eppendorf公司产品；电泳凝胶图像分析系统：上海天／H-‘匕la科技有限公司产品；半干转膜仪：美国Bio．rad公司成品；垂直蛋白电泳仪(DYCZ．24)：北京六一仪器厂产品。1．2方法1．2．1引物参考NCBI基因库HEV中国T1株序列设计扩增HEVORF2部分基因片段(HEVORF2 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析．A)巢式引物，外套引物，Alf：GTTTCTGGGGTGACCGGGT(C)TGATT，Alr：AGTA(Cfr)GAT(C)TGAAAA(G)GCA(G)CAG(A)CCCTG；内套引物，A2f：GC—GGA—TCCT觚ATTCATCCAACCAATCCCTTCG，A2r：GCC丛鱼￡ⅡCTCAGGGCAGAAATCATCGAAAGTG。其中内套引物上游和下游划线部分分别为BamHI和HindlII酶切位点。扩增HEVORF2．A上三段连续的基因片段的引物序列分别为：Blf．GCGGATCCT觚ATTCATCCAACCAATCCCT，Blr：GCC丛Q￡ⅡAATCACCAGCTCAGAGGCTAI’AC；B2f：GC鱼鱼△I￡￡CCTAGTGAACGCCTGCATTACCG，B2r：GCC丛鱼盟TCGGGACTCACCAAGGTCAATAT；B3f：GCGGATCCGTAGTCATCCAGGATTATGACAATC，B3r：GCCAAGC盟CTCAGGGCAGAAATCGAAAG，三对引物的上游和下游划线部分别为BamHI和肺胛讲II酶切位点。引物由上海生工生物工程公司合成。1．2．2HEVORF2部分片段的扩增．一按常规方法提取病毒RNA，以Alr为反向引物反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。预期目的片段HEVORF2．A长1725bp。两轮PCR扩增程序均为：95"C预变性7min；95℃变性lmin；56"C退火1min；72℃延伸2min；最后72。C延伸10min，共扩增35个循环。PCR扩增产物电泳，胶回收后与克隆载体pMDl8．T连接。重组质粒经PCR、酶切鉴定和测序验证正确后，命名pMDl8．T-HEVORF2一A。1．2．3HEVORF2．A与参考序列同源性比较将HEVORF2．A与Genbank上登录的序列进行同源性比较。1．2．4HEVORF2．A三段连续基因片段的扩增以pMDl8-T-HEVORF2．A为模板进行PCR扩增。根据上述1．2．1的3对引物分别扩增HEVORF2．A上三段连续的基因片段，预期目的片段长分别为576bp、573bp、576bp，命名为HEVORF2．B1，HEVORF2．B2，HEVORF2．B3。扩增程序均为95℃预变性7min；94。C变性50s：55。C退火50s；72"C延伸50s；最后72。C延伸7min；共扩增35个循环。1．2．5四个基因pET32a(+)重组表达质粒的构建HEVORF2．A，HEVORF2．B1，HEVOI强2．B2，HEVORF2．B3四个基因片段PCR扩增后进行电泳、胶回收，其后用BamHI和HindIII对四个基因回收产物和pET32a(+)空载体分别进行双酶切，酶切产物分别进行电泳、胶回收，回收产物进行T4连接酶连接。连接程序为：47 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析T4连接酶llxlBufferlp,1酶切好的pET32a空载体3p,l酶切好的目的片段5lxl总体积101xl置连接仪内16℃连接过夜。1．2．6重组质粒酶切和PCR鉴定方法同研究二中1．2．6．4相同。1．2．7表达重组质粒序列测定将构建好的阳性质粒送上海生工生物工程公司进行基因测序。1．2．8融合蛋白的诱导表达将构建好的四个表达质粒pET32a-A，pET32a—BI，pET32a-B2，pET32a-B3转让BL21(DE3)plysS感受态细胞，转化成功后将阳性单克隆菌落分别接于4mlLB培养基，37*(2振荡培养至OD600=0．6．1．O时，加入蛋白诱导剂IPTG使浓度达1mmol／L(同时设立pET32a(+)_-_-_空载体对照和阴性对照，阴性对照不加IPTG)，继续培养6小时，10000rpm离心60秒收集菌体，弃上清，加PBS液悬浮菌体，将蛋白制备液与80％2倍上样缓冲液和20％3-巯基乙醇混合，煮沸3．5分钟后进行蛋白垂直电泳(SDS—PAGE电泳)或一20*(2保存备用。1．2．9SDS．PAGE电泳(1)12％的分离胶制备：30％Acr-Bis32009l蒸馏水2640p11．5molTris—HCI(pH8．8、2000p110％APS80I_tl1O％SDS801．tlTEMED41xl总体积(2)5％的积层胶的制备：蒸馏水8ml2100“1 广西大学硕士学位论文广茜猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析30％Acr-Bis0．5molTris—HCI(pH6．8)10％APS10％SDSTEMED500pl380pl30pl4pl总体积3m1(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶的制作SDS．PAGE电泳槽使用前的处理：将玻璃板、Teflon梳子、平衡用玻璃板、固定板等清洁干净，晾干。灌胶：将配制好的分离胶灌注到胶室里。当分离胶的顶端到达胶室的2／3处时，在分离胶顶端加入少量蒸馏水，以便除去气泡和隔氧；待胶聚合后，去掉分离胶上的水，然后灌注浓缩胶(在灌胶的过程中应避免气泡产生)；浓缩胶灌完后立刻插入试样格(Teflon梳子)。(4)加样在电泳槽内加入缓冲液，按预定顺序加样，每个加样孔加样品10．20111。(5)电泳加样结束后将电泳装置与电源相接，设置电压为100V，当样品进入分离胶后，调为120V，待溴酚蓝指示剂接近分离胶底缘时，电泳结束。取出胶板，切除积层胶。(6)染色和脱色将分离胶浸于染色液中染色1小时，倾去染色液，用清水轻轻冲洗将附着在胶上的染液清理掉。放沸水中煮沸半个小时(途中多次更换清水)，至凝胶条带清晰可见为止。1．2．10Western．blot检测(1)胶平衡：使用前将裁剪与胶相同大小的PVDF膜用甲醇浸泡3—5分钟，然后将PVDF膜、分离胶、3MM滤纸(与膜相同大小)在lx平衡液浸泡30分钟。(2)半干转膜：转膜装置从下至上依次按3MM滤纸、PVDF膜、凝胶、3层3MM滤纸的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜应精确对齐，每一步小心除去气泡。接通电源，60V转膜2小时。(3)转移结束后，进行免疫印迹。(4)免疫印迹：49 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和彰i舅啦分析①将转印好的PVDF膜放入平皿，加入封闭液，4"C封闭过夜。②弃封闭液，加TTBS于放置膜的平皿内置摇床轻轻振荡洗膜，清洗4次，每次10分钟。③加入一抗置37*(2温箱孵育2h，每15分钟轻微混匀一次。④弃一抗，用TTBS洗膜，方法同②。⑤加入二抗置37℃温箱孵育2h，每15分钟轻微混匀一次。⑥弃二抗，用TTBS洗膜，方法同②。⑦用增强型HRP．DAB底物显色试剂盒显色，避光显色至出现清晰条带时加入双蒸水终止反应。2．结果2．1HEVORF2．A片段的扩增通过设计好的引物从新鲜猪粪抽提的HEVRNA反转录产物中扩增到长约1725bp的-gr片段，与预期片段大小相一致(图3．1)。M122000bp1000bp1725bp图3一lHEVORF2-A基冈的PCR扩增Fig．3一IAmplificationproductofHEVORF2一AgeneM：DNA分子质量标准；l，2：HEVORF2-AM：DL2000DNAMarker；1．2：HEVORF2-A2．2HEVORF2．A与参考序列同源性比较使用DNAstar软件对HEVORF2一A测序结果与参考序列进行同源性比较，结果显示与中国戊型肝炎病毒代表株Tl株(AJ272108)核苷酸和氨基酸同源性分别为86．1％和97．2％。与Li等‘174l从广西扩增到的毒株swGX40(EU676172)I约核苷酸和氨基酸同源性最高，分别为94．4％和98．8％。2．3HEVORF2．A三段连续基因片段的扩增 以B1f／B1r,B2f／B2r,B3f／B3r为引物，以pMDl8T-HEVORF2．A为模板进行PCR扩增，分别扩增到了三段长约570bp的片段，与预期片段大小相符(图3-2)。2000bp750bo600bpM1M2123约570bp图3-2HEVORF2．Bl／B2／B3基因的PCR扩增Fig．3-2AmplificationproductsofHEVORF2-B1／B2／B3genesM1，M2：DNA分子质量标准；l：HEVORF2一BI；2：HEVORF2-B2：3：HEVORF2-B3MI：DL2000DNAMarker；M2：DL-600DNAMarker；1：HEVORF2·BI；2：HEVORF2-B2；3：HEVORF2一B32．4重组表达质粒的构建和鉴定重组表达质粒用BamHI和HindlII双酶切后分别得到了5900bp和约1725bp、5900bp和约576bp、5900bp和约573bp、5900bp和约576bp的片段，与预期片段大小相符(图3．3)。酶切鉴定表明，成功构建了四个表达质粒，分别命名为pET32a-A、pET32a—B1、pET32a-B2、pET32a-B3。600bpMll2345678M2M315000bp2500bp图3．3重组质粒酶切鉴定电泳图Fig．3．3IdentificationofrecombinantplasmidsMI，M2，M3：DNA分子质量标准；1-8：重组表达质粒BamHl+HindlIl双酶切产物；I，2：pET32a-A；3，4：pET32a-BI；5，6：pET32a-B2；7，8：pET32a-B3Ml：DL600DNAMarker；M2：DL2000DNAMarker；M3：DLl5000DINAMarker；1-8：ProductsfromrecombinantplasrnidsdigestedwithBamHl+HindlII；l，2：pET32a-A；3，4：pET32a-BI；5，6：pET32a-B2；7’8：pET32a-B3 广两大学硕士学位论文广两猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析2．5表达质粒序列测定将构建好的表达质粒送上海生工测序。测序结果显示，目的基因与pET32a载体正确连接。2．6SDS。PAGE电泳分析37℃诱导6小时后进行SDS．PAGE电泳分析，结果显示pET32a-A在82．6kd处有微量的融合蛋白表达条带：pET32a-B1，pET32a-B2，pET32a．B3分别在41．3kd，41．5kd，41．8kd处均有大量的融合蛋白表达条带。pET32a(+)空载体对照在21kd处有小量的蛋白带(图3-4)。l2345M789lo118kd90kd50kd34kd26kd19kd图3．4SD§队GE电泳图Fig．3-4ResultsofSDs-队GEl·5：pET32a-BI．pE'132a-B2，pET32a-B3，pET32a-A，p圈r32a(+)经lmmol／LWIG诱导6小时；6-9：pET32a-B1，pET32a-B2，pET32a-B3，pET32a-A未经IPTG诱导；M：蛋白质分子质量标准i-5：pET32a-BI，pET32a-B2，pE'132a-B3，pE'r32a-A,pET32a(+)inductedwithlmmoi／LIFI'Gfor6h；6-9：pET32a-B1，pET32a-B2，pET32a-B3，pET32a-AwithoutinductedwithIPTG；M：ProteinmolecularweightM栅2．7Western-blot抗原性检测通过自然感染猪血清和北京万泰HEVELISA诊断试剂盒阳性对照血清及HRP标记的兔抗猪IgG进行Western-blot检测，结果显示构建的四个表达载体均具有抗原性，除pET32a-A在82．6kd处仅检测到细小条带外，pET32a-B1，pET32a-B2，pET32a-B3分别在41．3kd，41．5l【d，41．8kd处均能检测到明显的条带(图3-5／6)。118kd90kd50kd34kd26kd19kdl2345M6789r’⋯⋯⋯一⋯’⋯一”’””⋯器一⋯一⋯’一～1I一目睁ll慧，。瓤霸。{l‰墟r'w、．V～一步一纛”j”曩■j}■黪1I-”jl⋯⋯⋯⋯～～⋯⋯+⋯。⋯j图3．5自然感染猪血清Westernblot检测结果Fig．3-5Westernblotdetectedresultsofserumofnaturalinfectedpig 广西大学硕士学位论文广两猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析1-5：pET32a-A，pET32a-BI，pET32a-B2，pET32a-B3，pET32a(+)经Immol／LIFFG诱导6；6-9：pET32a-A，pET32a-B1，pET32a-B2，pET32a-B3未经IPTG诱导；M：蛋白质分子质量标准I-5：pET32a-A,pET32a-BI，pET32a-B2，pET32a-B3，pEl"32a(+)inductedwithImmol／LIFFGfor6h；6-9：pET32a-A,pEl32a-B!，pEl32a-B2，pET32a-B3withoutinductedwithIFFG；M：ProteinmolecularweightMarker118kd90kd50kd34kd26kd19kdl2345M6789}畛诋·椭艨i图3—6北京万泰戊型肝炎ELISA诊断试剂盒阳性对照血清Westernblot检测结果Fig．3-6WesternblotdetectedresultsofpositivecontrolsertmlinHEVELISAdiagnostic：kitof8eijiIljgWantail一5：pET32a(+)，pET32a-A，pET32a-BI，pET32a-B2，pET32a-B3经immoFLIFFG诱导6小时；6-9：pET32a-A，pET32a-B!，pET32a-B2，pET32a-B3未经IPTG诱导；M：蛋白质分子质量标准l-5：pET32a(+),pET32a-A,pET32a-BI，pET32a-B2，pET32a-B3inducted训tIlImmol／LIPTGfor611；6-9：pET32a-A,pET32a-BI，pET32a-B2,pET32a-B3withoutinductedwithIFrG；M：ProteinmolecularweightMarker3．讨论与分析HE在世界各地均有发生与流行，主要是通过粪口途径的方式传播。现已证实人及多种动物均可感染HEV。HEV主要感染青壮年，死亡率约为1％-2％，但怀孕妇女感染死亡率可高达到25％【4】。在发展中国家特别是生活条件低下的亚洲、非洲、拉丁美洲国家，HE是一个严重的公共卫生问题。除此之外，在许多发达国家，包括美国、欧洲等也有散发性病例的报道，而且令人惊奇的是这些发达国家人群很少与动物接触但也出现了较高的HEV抗体阳性率【5，-801。越来越多的流行病学研究表明，HE是一种重要的人畜共患性传染病【106,1761。将扩增的广西HEVORF2-A与Genbank上登录的HEV基因序列进行同源性比较，结果显示与中国代表株中国Tl株的核苷酸同源性为86．1％，氨基酸同源性为97．2％。在参考序列中与广西本地株swGX40核苷酸和氨基酸同源性均最高，分别为94．4％和 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析98．8％，而与其它国内外毒株的参考序列普遍较低。以往的研究己证实，同一区域HEV毒株的核苷酸及氨基酸序列同源性明显高于不同区域之间的毒株的同源性142，177】，本研究结果与此结论相符。SDS．PAGE电泳结果表明，所构建的四个表达载体均有蛋白表达，主要以包涵体的形式存在。其中pET32a．B1，pET32a-B2，pET32a．B3为高水平表达，pET32a．A相对较少。4个表达质粒的表达条件均相同，但具有较长片段的pET32a-A的表达量明显不如短片段，是否由于pET32a-A受到稀有密码子、疏水区、蛋白毒性等因素的影响还需进一步探讨。Western．blot结果显示四个表达蛋白均能观察到明显的反应条带，表明四个表达蛋白具有抗原性或生物学活性。其中三个截短的表达蛋白与阳性血清反应更强，具有更好的抗原性。HEV抗原决定簇主要分布于ORF2和ORF3区域，ORF2和ORF3内编码的不同抗原片段诱导的抗体是不同的，抗体产生的时间也不一致。目前市场上销售的HEV诊断试剂盒是根据HEV不同的基因片段研制的，在诊断结果方面存在着一定的差异f1811。因此探索HEVORF2不同区域的抗原性，筛选出敏感性强、特异性好、有互补或增强作用的基因片段及其组合，对于研制更有效的诊断试剂具有重要意义。以往的研究均基于通过软件筛选抗原性强、亲水性好的基因作为目的基因，绝大部分都选择于ORF2的C端，而对于HEVORF2不同的部位，特别是N端片段研究较少。本研究Western．blot结果表明，HEVORF2的N端或中间部分所表达的蛋白均能高效地与自然感染猪血清或万泰试剂盒阳性血清反应。这就提示除C端区域含有两个中和表位(ORF2578aa和ORF2607aa)【25】外，在HEVORF2其它区域也存在潜在的特异性抗原表位，可作为研制基因工程疫苗及ELISA诊断试剂盒的候选基因。HEVORF2为戊型肝炎病毒的衣壳蛋白，含有多种抗原表位，是诊断试剂和基因工程疫苗研究的理想基因。早期，国内诊断试剂或疫苗的研究主要基于酵母表达系统表达几乎全长的HEVORF2蛋白，如苏彩霞掣1821利用甲基营养型汉逊酵母系统表达基因型Ⅳ型HEVORF2112．607氨基酸编码的基因片段；佟玉品等【183】利用甲醇营养型酵母表达系统表达HEVORF269．660氨基酸编码的基因片段，这两个表达系统表达的蛋白均有高的表达量及抗原性。随着对抗原蛋白一级结构与空间结构的深入研究，逐渐认识到全蛋白基因中多种抗原表位所编码的基因序列以及其他免疫抑制、调控序列等的存在有可能会影响靶抗原的表达以及中和表位的免疫优势地位。因此，对抗原性蛋白的研究就从 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析最初基于全基因发展到基于含功能性中和表位的短基因片段【l洲。至今发现的唯一HEV中和表位位于HEVORF2578．607氨基酸之间的区域，因此，HEV抗原性的研究就围绕于该区域。于婧等【185J在大肠杆菌中表达猪戊型肝炎病毒ORF2主要结构蛋白，位于ORF21159．1819bp，Westernblot和间接ELISA方法分析显示该蛋白具有抗原性；阮冰等Il弱J通过大肠杆菌表达系统表达HEV基因型I型ORF2近3’端的492bp片段，表达的蛋白应用于ELISA诊断，与Genelabs公司HEVELISA试剂盒比较，一致率为96．9％；葛胜祥等【197J利用谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达载体在大肠杆菌中表达了HEVORF2394．604aa的区域(E2)，结果发现在SDS．PAGE中可形成二聚体，而且二聚体对戊肝阳性血清的反应性要明显优于单体，该重组蛋白免疫恒河猴显示出一定的保护性【188，189]。本研究的四个表达载体pET32a-A，pET32a．B1，pET32a．B2，pET32a-B3分别位于HEVORF2205—1929bp(69aa-643aa)，205bp-780bp(69aa-260aa)，781—1353bp(261aa-451aa)，1354．1929bp(452aa-643aa)之间。其中pET32a．B3与上述短片段部分重叠或完全包含且包含578．607氨基酸区域，结果显示表达产物量高并且能与阳性血清有强烈的反应，结果与以往研究相似。另外两个短片段的表达载体，目前尚未发现有关报道，其表达产物的活性在本研究中与pET32a．B3相似，这两个表达载体适用于诊断试剂还是基因工程疫苗还有待于进一步研究。大量研究数据已证实国内HEV感染较为普遍【117，12们。但是目前尚未建立有效的HEV培养系统，不能通过培养HEV研制常规预防疫苗。因而基因工程疫苗成为HEV疫苗研究的重点。目前大部分的研究集中于HEVORF2，并已确定部分表达蛋白能产生中和抗体，并在体内或体外中和病毒【154，1551。本研究将深入探讨广西HEVORF2的3个抗原片段产生中和抗体的能力，为进一步研制基因工程疫苗提供理论基础。 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析三结论1．本研究通过RT-nested．PCR的方法对13个不同规模猪场采集的135份新鲜猪粪进行检测。结果显示阳性率为28．1％。在调查的13个猪场中，仅有1个猪场未检测到HEVRNA，猪场阳性率为92．3％。各猪场样品检出率在0．44．4％之间，13个猪场中有8个猪场感染率处在30．45％之间。2．对6个猪场不同年龄猪群进行感染率调查，在67份不同月龄的样品中，0．30日龄HEVRNA阳性率为O％；31．60日龄阳性率为5．3％；61．90日龄HEVRNA阳性率为40％；91．120日龄HEVRNA阳性率为58．8％；大于120日龄HEVRNA阳性率为30．8％。结果显示2-4月龄为猪群的感染高峰期，32份样品中有16份样品为HEVRNA阳性，阳性率为50％。3．同源性比较显示，20株分离株间核苷酸同源性为91．2．99．7％。分离株与基因型I型、Ⅱ型、IⅡ型、Ⅳ型及禽HEV参考序列核苷酸同源性分别为：78．6．83．4％，75．9．77．9％，75．3．81．4％，83．4—97．7％；55．6．58．9％。20株分离株间氨基酸同源性为97．7．100％，与基因型I型、II型、Ⅲ型、Ⅳ型及禽HEV参考株氨基酸同源性分别为：92．4．95．5％、93．1．93．9％、94．7．97％、97．7．100％、55．6．56．5％。4．进化树显示，本研究得到的20株序列属于基因型Ⅳ型。分离株与所有Ⅳ型参考序列可分为6个亚型，分别为亚型a、b、C、d、e、f，所有的分离株分布在亚型b中。5．本研究构建的四个重组表达质粒pET32a-A，pET32a-B1，pET32a—B2，pET32a-B3经lmmol／L的IPTG在37。C诱导6小时后，除pET32a-A在82．6kd处有微量融合蛋白表达外，pET32a-B1，pET32a-B2，pET32a-B3分别在41．3kd、41．5kd、41．8kd处有高水平的融合蛋白表达。用自然感染猪血清和万泰HEVELISA诊断试剂盒阳性对照血清进行westernblot检测，三个短的融合蛋白均能检测到明显的条带，表明本研究所构建的三个表达载体具有良好的抗原性。 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析参考文献【1】EmersonSU，NguyenH，GraffJ，eta1．InvitroreplicationofhepatitisEvirus(IaEV)genomesandofanHEVrepliconexpressinggreenfluorescentprotein．叨．JVir01．2004，78(9)：4838-4846．【2】ReyesGRPurdyMA，KimJP，eta1．IsolationofacDNAfromthevirusresponsibleforentericallytransmittednon—A，non—Bhepatitis．叨．Science．1990，247(4948)：1335—1339．【3】HuangCC，NguyenD，FernandezJ，eta1．MolecularcloningandsequencingoftheMexicoisolateofhepatitisEvirus(HEV)．[J】．Virology．1992，191(2)：550—558．【4]KhurooMS，TeliMR，SkidmoreS，eta1．Incidenceandseverityofviralhepatitisinpregnancy．【J】．AmJMed．1981，70(2)：252-255．[5】MengXJ，WisemanB，ElvingerF，eta1．PrevalenceofantibodiestohepatitisEvirusinveterinariansworkingwitllswineandinnormalblooddonorsintheUnitedStatesandothercountries．【J】．JClinMicrobi01．2002，40(1)：117-122．【6】ArankalleVA，ChobeLP，ChadhaMS．Type—IVIndianswineHEVinfectsrhesusmonkeys[J]．Journalofviralhepatitis．2006，13(11)：742—745．[7】HalburPG，KasomdorkbuaC，GilbertC，eta1．ComparativepathogenesisofinfectionofpigswithhepatitisEvirusesrecoveredfromapigandahuman．[J】．JClinMicrobi01．2001，39(3)：918—923．[8】ViswanathanR．InfectioushepatitisinDelhi(1955-1956)：acriticalstudy；epidemiology[J]．IndianJMedRes．1957，45(1)．【9】KhurooMS．Studyofanepidemicofnon-A，non-Bhepatitis．Possibilityofanotherhumanhepatitisviresdistinctfrompost—transfusionnon—A，non-B够pe．[J】．AmJMed．1980，68(6)：8l8—824．【10】BalayanMS，AndjaparidzeAG，SavinskayaSS，eta1．Evidenceforavirusinnon—A，non—Bhepatitistransmittedviathefecal—oralroute．【J】．Intervirology．1983，20(1)：23-31．【11】AggarwalR，KrawczynskiK．HepatitisE：anoverviewandrecentadvancesinclinicalandlaboratoryresearch．[J】．JGastroenterolHepat01．2000，15(1)：9—20．[12]MengXJ．HepatitisEvirus：animalreservoirsandzoonoticrisk[J]．Veterinary57 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广西大学硕士学位论文￡堕壅垡型墅壅坌三鎏堡堕兰塑奎垄垄型墅丝堕耋竺堕!塑芝塑塑垫堕丝坌堡___--__--_●_———●-●_-_--__--_--—_—●__-●-—___●___●-__-—_—————————_—__——’___———————————————————————一一一interactionsbetweenabacteriallyexpressedrecombinantpeptideofthehepatitisEvirusstmctur．a1protein．[J]．JMedVir01．2001，64(2)：125—132． 广西大学硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析附录：英文缩写对照表74
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