大仓鼠SSR座位的筛选及黑线仓鼠MHC基因的克隆与序列分析

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1、摘要大仓鼠(Tscherskiatriton)和黑线仓鼠(Cricetulusbarabensis)在我国分布范围广，繁殖力极强，是危害农业、传播疾病的有害动物，因此本论文主要针对这两类害鼠展开分子生物学方面的研究。微卫星是一种较好的分子遗传标记，在种群进化研究、种群结构分析、遗传多样性等研究中得到了广泛的应用。大仓鼠(Tscherskiatriton)是广泛分布于我国长江以北的重要害鼠之一。过去关于大仓鼠微卫星座位的筛选、利用其进行遗传多样性研究的报道较少。研究一使用经典的酚／氯仿抽提法从保存于．70

2、℃的肝脏组织中提纯北京顺义、河北固安、饶阳等地区大仓鼠的基因组DNA，并利用大仓鼠近缘种一原仓鼠(Cricetuscricetus)、金仓鼠(Mesocricetusauratus)和黑线仓鼠(Cricetulusbarabensis)的10对微卫星引物(LOC．1至LOC．6；SSRl至ssrfl1)，通过PCR扩增筛选大仓鼠的微卫星座位，并对可能含有微卫星的阳性克隆进行测序，最终得到33个微卫星序列。利用BLAST序列分析软件对GenBank数据库进行检索，没有找到同源性一致的相应微卫星序列，表明3

3、3个大仓鼠微卫星序列都是首次发现的。注册序列的GenBank登陆号为EF690673～EF690693，EUl40825"-一EUl40836。这些微卫星序列可以分成三类：完美型占39．4％，非完美型占24．2％，复合型占36．4％。另外可见重复次数在8"-'20的微卫星序列最多，占60．6％，重复次数在21次以上的占39．4％。大部分微卫星序列的二核苷酸重复次数均在12以上，可以进行后续大仓鼠微卫星引物设计和相应的种群多态性分析。主要组织相容性复合体(MHC)是由紧密连锁、高度多态的基因位点所组成的染

4、色体上的一个区域，MHC基因具有高度多态性，对于维持种属的生存与延续具有重要的生物学意义。MHC的突出特性及其重要的功能使其在免疫遗传学、群体遗传学和抗病育种学等领域具有独特的效力。研究二应用MHCI类基因来探讨黑线仓鼠种群间的遗传结构，寻找分子遗传标记。根据已报道的四个黑线仓鼠MHCI类基因序列以及入、大鼠和小鼠的相应序列，设计了一对特异性引物(SSl)，从临沂沂南、潍坊临朐及曲阜吴村三个种群的黑线仓鼠基因组DNA中扩增了编码MHCI类0【2结构域的基因片段，并进行测序，得到的GenBank序列登录号

5、为：FJ619112"-'FJ619183。结果表明：(1)黑线仓鼠MHCI类砣结构域的序列多态性较为丰富，255bp长度中有41个多态位点，多态位点百分率为16．08％；(2)群体间遗传多样性存在差异：多态位点百分率为吴村(14．51％)>临朐(13．73％)>沂南(12．55％)；核苷酸多样性指数(Pi)为临朐(0．05278)>吴村(O．05097)>沂南(O．04884)；平均核苷酸差异数目(K)值为临朐(13．458)>吴村(12．998)>沂南(12．454)；单倍型多样性指数(Hd)都很高

6、，说明编码MHCI类分子0L2结构域基因的核苷酸序列的变异较大；基于单个多念位点的群体动态的遗传参数(0m)值则为吴村(O．03575)>临朐(O．03436)>沂南(0．03026)；(3)三个地理种群的氨基酸序列中均存在与抗原多肽结合的位点，且极其保守，序列编码区的蛋白质预测图均包含Gt螺旋和13折叠，吴村种群a螺旋略有差异；(4)种群间的遗传分化指数接近，单倍型出现交叉，说明三个种群间的遗传分化不明显；(5)多态性丰富的编码MHCI类分子以结构域的基因序列，适宜作为黑线仓鼠不同群体的分子遗传标记。

7、研究三对MHCII类DQA基因的外显子2进行克隆和序列分析。提取黑线仓鼠3个群体(吴村、沂南和临朐)的基因组DNA构建基因池，利用PCR扩增得到249bp的目的片段，将该目的片段连接到pMDl8．T载体中，重组质粒转入大肠杆菌DH5a后利用蓝白斑法筛选阳性克隆，测序后得到该目的片段的核苷酸序列(GenBank登录号：FJ209306)并推导出氨基酸序列。结果表明：黑线仓鼠、人、大鼠、小鼠、猪、马、牛、兔之间D鲥基因外显子2的核苷酸序列同源性为68．7％"--'85％，氨基酸序列同源性为56．8％'-'-

8、'83．5％，黑线仓鼠与大鼠、小鼠亲缘关系更近。测序得到的D剑基因外显子2序列具有丰富的种间多态性，可以作为物种遗传分析的分子标记。关键词：大仓鼠；SSR座位；黑线仓鼠；MHCI类0【2结构域；MHCII类；D幽基因；遗传变异ABSTRACTThelandscapesofTscherskiatritonandCricetulusbarabensisinChinaareveryextensive·Thetwospecieshavestrong