黑线仓鼠ob基因部分序列克隆和snp的分析

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1、课题来源国家重点基础研究发展计划(973计划)——“鼠类种群遗传结构动态及遗传调节机制"(2007CBl09104)国家自然科学基金项目——“黑线仓鼠不同地理种群遗传变异与生态适应研究"(30670335)～；}；摘要黑线仓鼠是我国北方的一种主要害鼠，由于其分布范围广，繁殖力极强，严重危害农业的发展和人类正常的生产生活，所以越来越多的研究围绕其展开。本论文主要是对黑线仓鼠进行了分子生物学方面的研究。OB基因主要在脂肪组织中表达，其表达产物瘦素(Lcptin)是新近发现的一种蛋白质激素。它对动物摄食、能量代谢、脂肪存储、

2、生殖活动、胚胎及青春期发育、造血功能、神经内分泌、免疫等都有重要的调控作用，对于维持种属的生存与延续具有重要的生物学意义。本研究通过对OB基因的克隆和分析来探讨黑线仓鼠种群间的遗传结构。研究根据GencBank数据库中包括大鼠、小鼠等多种近源物种的OB基因设计引物，利用PCR法首次在黑线仓鼠中克隆出OB基因1665(1664)bp，其中包含完整内含子2区段和外显子2、外显子3部分区段，外显子区段包含完整的OB基因CDS序列，翻译后得到包含167个氨基酸残基的蛋白质序列；同时，在本实验中还从沂南、临朐和曲阜三个地理种群共

3、随机挑选103个黑线仓鼠个体分别进行扩增和序列测定，结果发现19个SNPs，1个插入／

4、缺失位点，共定义了34种单倍型，在GcnBank注册序列号为：HMl00043一HMl00076。将实验获得的黑线仓鼠OB基因中mRNA序列与其它多个物种的相应序列进行比对，与大部分哺乳动物在核苷酸水平有较高同源性(82．3％～100％)，同时在氨基酸水平上也具有较高同源性(70．1％～100％)。用DnaSPv5．0软件分别计算三个地理种群黑线仓鼠OB基因核苷酸多样性(兀)、单倍型数目(H)、单倍型多样性(Hd)、平均核苷酸差异数

5、(K)、多态位点数(S)和基于分离位点数目的多样性(ew)，发现遗传多样性水平具有临朐种群>沂南种群>曲阜种群的特点。三个地理种群间的种群问遗传分化系数(Fst)、基因流(Nm)、种群间的核苷酸歧异度(Dxy)等显示沂南、临朐和曲阜三个地理种群黑线仓鼠OB基因均具有一定遗传分化但不显著。在种群间，曲阜和临朐两个地区遗传分化最大，基因交流较小；曲阜和沂南地区次之；临朐和沂南地区遗传分化最小，基因交流较大。种群遗传分化系数(Gst)在0．00455。0．06523之间，说明有93％以上的变异来自于种群内部。实验中用MEGA

6、4．0软件对三个地理种群黑线仓鼠个体做NJ系统进化分析，结果表明三个地理种群黑线仓鼠遗传分化不明显。本研究发现山东地区黑线仓鼠OB基因存在丰富的核苷酸多样性和单倍型多样性，沂南、临朐和曲阜三个地理种群间遗传分化程度很小。本研究还测定了66个黑线仓鼠的体脂含量，并对其OB基因的序列进行分析，结果发现，在第三外显子编码区上发现三个同义突变C263T、A481G、ASllG，OB基因编码区存在4种单倍型。经SPSSl7．0分析，四种单倍型的黑线仓鼠的体脂含量均存在显著性差异(P<0．05)，由于这些突变不能引起氨基酸产物序列

7、的变化，基本不影响蛋白质活性，从而不会使动物表现出明显的性状变化，故认为此基因突变并不是性状变异的主要原因。不同单倍型黑线仓鼠体脂含量的显著性差异可能是由其他原因引起的。不同单倍型与脂肪含量’lll。。‘。-——1。。。‘。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。‘。。。。。。。。。。。。。l之间的关系以及OB基因多态性对脂肪蓄积的基因效应还会通过扩大样本后作进一步研究。另外，关于OB基因与黑线仓鼠繁殖、免疫等功能在基因水平上的相关性也有待于进一步研究。关键词：黑线仓鼠；OB基因；克隆；遗传变异；体脂含量Il

8、IAbstractCricetulusbarabensisarewidelydistributedinChinaandhavestrongreproductiveability．Thespecieshavebeenconsideredasdeleteriousanimalsforagricultureandindustry,whichisaseriousthreattopeople’normalproductionandlife．Inrecentyears，Cbarabensisasthedominantrodents

9、peciesinNorthofChinahasevokedmoreandmoreconogrnsamongtheacademiccircles，andmanyresearchesoutcomesspring．Intheseexperimentstheauthorinvestigatefromtheviewpointofmolecu