氨基酸营养缺陷性筛选和鉴定

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1、氨基酸营养缺陷性的筛选与鉴定————芽孢杆菌实验目的1.学习营养缺陷型突变菌株的筛选2.掌握营养缺陷型的诱变以及筛选鉴定实验原理芽孢杆菌芽孢杆菌（Bacillaceae），细菌的一科，能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌bacillus杆菌科的一属细菌。特性1.繁殖快速：代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。2.生命力强：无湿状态可耐低温－60℃

2、、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厌氧繁殖）。3.体积大：体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。实验流程诱变处理淘汰野生型营养缺陷型的检出鉴定缺陷型诱变方法物理诱变应用较多的是辐射诱变，即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异化学诱变化学诱变除能引起基因突变外，还具有和辐射相类似的生物学效应，如引起染色体断裂等，常用于处理迟发突变，并对某特定的基因或核酸有选择性作用。化学诱变剂主要有：①烷化剂。这类物质含有1

3、个或多个活跃的烷基，能转移到电子密度较高的分子中去，置换其他分子中的氢原子而使碱基改变。常用的有甲基磺酸乙酯(EMS）、乙烯亚胺（EI）、亚硝基乙基脲烷（NEU）、亚硝基甲基脲烷（NMU）、硫酸二乙酯（DES）等。②核酸碱基类似物。为一类与DNA碱基相类似的化合物。渗入DNA后，可使DNA复制发生配对上的错误。常用的有5-溴尿嘧啶(BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR）等。③抗生素。如重氮丝氨酸、丝裂毒素C等，具有破坏DNA和核酸的能力，从而可造成染色体断裂。淘汰野生型菌株的方法有抗生素法：细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分

4、为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。高温杀菌法：利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，让诱变后的细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌

5、移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80℃，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留，起到了浓缩作用。菌丝过滤法：真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔3~4h过滤一次，重复3~4次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀释、涂皿分离。营养缺陷型的检出点植对照

6、法法诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证。该法可靠性强，但工作量大。影印法经富集后的孢子或菌体分离在完全培养基培养至菌落成熟（母皿），用灭菌后的特制“丝绒印模”在母皿平板菌落上轻轻一印，再转印到方位相同的另一基本培养基和

7、完全培养基的平板上。培养后观察比较菌落生长情况，凡是在基本培养基上不生长，而在完全培养基上生长的菌落，分别移接到以上两种培养基斜面上进一步复证。另外还可采用更简便的方法，以上印模从母皿中沾上菌体细胞后，仅影印在基本培养基平板上，培养后，生长的菌落情况与存放于冰箱的母皿菌落比较即可检出营养缺陷型。本法适用于细菌、酵母菌，其次对小型菌落的放线菌和霉菌也适用。限量补充培养法如果试验的目的仅是检出营养缺陷型菌株，则其该法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01%蛋白胨的基本培养基上，培养后，野生型细胞迅速地长成大菌落，在平皿底部作好颜色

8、标记，而生长缓慢的小菌落可能是缺陷型，此称限量培养。如果试验的目的是要定向筛选某种特定的缺陷型，则可在基本培养基中加入某种单一的氨基酸、维生素或碱基等物质，称为补充培养。夹层培养法先在培养皿上倒一薄层基本培养基，凝固后再倒一层经过诱变处理的菌液，其上再浇一层基本培养基；经培养