小鼠内抑素基因及其突变体在Ecoli中的表达重组蛋白的复性和活性研究

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1、中国海洋大学硕士学位论文小鼠内抑素基因及其突变体在E.coli中的表达重组蛋白的复性和活性研究姓名：路新枝申请学位级别：硕士专业：生药学指导教师：于文功2003.6.1小鼠内抑素基因及其突变体在E．coli中的表达，重组堑白的复性和活性研究内抑素(Endostatin)是胶原xⅧ的羧基末端片段，分子量为20KD。它是一种强烈的血管生成抑制因子，具有高效的抗肿瘤作用，内抑素的研究为肿瘤的血管靶向性治疗开辟了一条前景广阔的新途径。由于生物体内天然的内抑素含量很低，无法满足临床实验要求，而采用基因工程技术可以得到大量高纯度、活

2、性稳定、质量易得到保障的重组内抑素，是内抑素研究和应用的必然方向。目前内抑素已经在大肠杆菌等原核生物和酵母等真核生物中成功表达，但是大肠杆菌表达的内抑素主要以无活性的包涵体形式存在，不利于机体吸收利用。酵母等真核生物表达的内抑素虽然是可溶的，但是由于表达量只有原核生物的1／3左右，而且真核生物表达体系生产成本昂贵，严重制约了内抑素的大量生产和应用。本文克隆、重组表达了小鼠内抑素基因，并将前期研究工作中利用噬菌体展示技术筛选到的两个肿瘤组织靶向性短肽重组于内抑素的N末端，构建了小鼠内抑素的两个突变体MEl和ME2。三种蛋白

3、在大肠杆菌中得到高效表达，但是主要以包涵体形式存在，在除掉变性剂的过程中99％以上的蛋白析出。通过对重组内抑素包涵体复性条件的系统研究，包括复性起始浓度，PH值，极性、非极性小分子添加剂，氧化还原剂，表面活性剂和共溶剂PEG等影响因素，我们建立了一种简单而有效的重组小鼠内抑素包涵体蛋白的复性方法，在起始浓度为1mg／ml的条件下，不使用任何表面活性剂，复性效率可达到60％以上，而在复性过程中沉淀出的蛋白可以重新溶解变性后，用于新一轮的复性。利用这种方法我们从1L培养液中得到约120mg有活性的重组小鼠内抑素蛋白或其突变体

4、。通过体外人脐静脉内皮细胞(HUvEC)的贴壁和增殖抑制实验及鸡胚尿囊膜(CAM)实验，检测了内抑素和其两个突变体复性后的活性。实验结果表明，无论是体内实验还是体外实验，两个突变体的活性明显高于正常内抑素组，其中突变体MEl的效果比突变体ME2稍弱。在体外实验中，预先包被在培养皿上的内抑素或其突变体能够促进细胞的贴壁生长，延缓饥饿条件引起的HUVEC调亡。而游离的内抑素能抑制bFGF诱导的HUVEC增殖，并引起HUVEC的调亡。体内CAM实验表明重组内抑素和两个突变体均能抑制bFGF诱导的血管生成，其中MEl突变体的血管

5、新生抑制率达60％以上，ME2的抑制率达90％以上。本论文建立了一个高效且简便的大肠杆菌表达体系中内抑素包涵体复性的技术平台，有助于大量制备具有生物活性的可溶性的重组内抑素，为深入开展内小鼠内抑索基因及其突变体在E．coil中的表达．承组蛋白的复性和活性研究抑素的基础和临床应用研究创造了条件。并且实验中新构建的两个突变体活性明显高于正常内抑素组，为研究内抑素的作用机理提供了新思路，对于寻找高活性和高特异性的抗血管新生药物开辟了新途径。关键词：内抑素，突变体，复性，血管新生，CAM2小鼠内抑索基因及其突变体在E．coli中

6、的表达，重组蛋白的复性和活性研究Endostatin，isastrongangiogenesisinhibitorwhichisa20一kDaC—terminalcleavageproductofcollagenXVIII．Ithasbeenshowntoregresstumorsinmice，withnotoxicsideeffectsobserved．Endostatinwasoriginallyisolatedfromthesupematantofaculturedmurinehemangioendotheliom

7、acelllineinwhichtheyieldWaslessthan2％．TheendostatingenehasbeenclonedandexpressedasarecombinantproteininEscherichiacoliandyeastexpressionsystems．Bacteriacouldproducelargequantitiesofrecombinantproteininrapid，ofteninexpensive，stableandhighpurity．However,recombinant

8、endostatinpreparedfromEscherichiacoliWasdepositedininsolubleandinactiveaggregatesorinclusionbodies，andmorethan99％proteinlostduringtherefoldingprocedure．Asolubl