氯霉素人工抗原的合成及多克隆抗体的制备_陆蕾

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1、第11卷第2期中国食品学报Vol．11No．22011年4月JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnologyApr．2011氯霉素人工抗原的合成及多克隆抗体的制备*陆蕾刘娜倪庚王琳郑晓冬（浙江大学生物系统工程与食品科学学院杭州310029）摘要采用重氮化法合成氯霉素人工抗原。通过紫外扫描、凝胶电泳、基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MAL-DI-TOFMS）鉴定人工抗原。用该人工抗原免疫兔子，获得多抗血清。采用酶联免疫法测定抗体效价，并对ELISA条件进行初步优化。选择与氯霉素结构相似的4种药物进行交叉反应，计算交叉反应

2、率。结果表明免疫抗原偶联率为1∶22，最佳包被抗原质量浓度为0.25μg/mL，抗体效价128000。优化后，通过间接竞争ELISA法建立标准曲线，IC50为0.26μg/mL，4种药物与抗体的交叉反应率均小于0.1%，特异性显著。关键词氯霉素；人工抗原；重氮化；优化文章编号1009-7848（2011）02-0177-08氯霉素（Chloramphenicol）是一种广谱抗菌类抗生素，尤其对革兰氏阴性菌有非常好的抑制作[1]用。因其对人体有严重的毒副作用，包括导致不可逆的再生障碍性贫血以及其他一些恶性血液[2]病，故包括美国在内的一些国家明文规定：在食图1氯霉素分子结

3、构品中不得检出氯霉素。Fig.1Moleculestructureofchloramphenicol然而，一些不法分子受利益驱使，仍然在食品中添加氯霉素，因此提高分析与检测技术是当务之急。目前检测氯霉素的方法主要有色谱法和免1材料与方法[3][4][5]疫技术。其中色谱法包括GC、LC、GC-MS、LC-1.1材料与试剂[6]MS等。这些方法虽然准确性高，但样品前处理繁氯霉素标准品，浙江省药检所；甲砜霉素标准琐，耗时长，需要专业人员操作，因此很难在基层品，中国药品生物制品检定所；氟苯尼考标准品，检测部门推广。而免疫技术检测时间短，结果可中国药品生物制品检定所；恩诺沙星，

4、浙江省药检[7]靠，已成为快速检测兽药的主要方法之一。所；诺氟沙星，浙江省药检所；牛血清蛋白（BSA），小分子氯霉素只有反应原性，没有免疫原性，上海生工生物工程技术有限公司；卵清蛋白（O-必须和大分子的载体蛋白偶联才能免疫动物制备VA），上海生工生物工程技术有限公司；四甲基联[8]抗体。本文通过还原氯霉素结构（见图1）中的硝苯胺（TMB），Sigma公司；辣根过氧化物酶标记的基，建立芳香伯胺，然后用重氮化反应与载体蛋白羊抗兔IgG（HRP-IgG），北京博奥森生物技术有限偶联，制备免疫抗原与包被抗原，为下一步制备氯公司；BCA试剂盒，碧云天试剂有限公司；甘氨酸，霉素EL

5、SIA试剂盒奠定基础。国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠、乙醇。1.2仪器与设备电子分析天平，Sartorius公司；磁力恒温搅拌收稿日期：2010-04-26器，上海沪西仪器分析技术厂有限公司；紫外分光基金项目：国家高技术研究发展计划项目光度计，Bechman公司；基质辅助激光解吸飞行时（No.2007AA10Z436）间质谱（MALDI-TOFMS），美国英杰生命技术有限作者简介：陆蕾，男，1986年出生，硕士生公司；多道可调式移液器，Eppendorf公司；96孔酶通讯作者：郑晓冬178中国食品学报2011年第2期标板，上海天呈科技有限公司。等量弗氏完全佐剂混合，

6、完全乳化后，采用背部皮1.3试验动物下5点注射白兔；3周以后，用200g免疫抗原与试验动物：新西兰大白兔。弗氏不完全佐剂混合，以相同的方法进行第2次1.4试验方法免疫。以后每两周免疫1次，共免疫8次。[9]1.4.1免疫抗原和包被抗原的制备（重氮化法）1.4.5血清效价测定操作步骤按照间接[10]称取CAP60mg，溶于1mL无水乙醇中，加入ELISA法。1）用碳酸缓冲液（CBS）将包被抗原稀12mL1mol/L盐酸中，加入锌粉70mg，于70℃释到一定浓度，包被酶标板，4℃包被过夜。2）水浴中加热50min。冷却后，在4℃，pH1～2条件PBST洗板，用2%的脱脂奶粉

7、封闭，37℃恒温箱内下逐滴加入0.5mol/LNaNO23.8mL，避光搅拌至孵育2h。3）PBST洗板，在酶标板第1行中加入淀粉碘化钾试纸呈灰蓝色，此溶液记为A液。100μLPBS溶液做空白对照，第2行中加入1∶称取BSA120mg，溶于10mL磷酸缓冲液200稀释度的阴性血清100μL，后面6行分别加（PBS，pH7.4）中，冷却。然后将A液边搅拌边缓慢入100μL系列稀释度的阳性血清，复孔平行试加入BSA溶液中，同时加入0.2mol/LNaOH，使验，37℃孵育1h。4）PBST洗板，加入6000倍稀pH始终保持在7～8，4℃搅拌1