百草枯人工抗原的合成及抗体的制备

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1、百草枯人工抗原的合成及抗体的制备：杨婷婷,孙秀兰,邵景东,王洪新【摘要】目的:制备百草枯人工抗原和抗血清,为建立酶联免疫吸附法提供技术储备。方法:以4,4’联吡啶和碘甲烷为起始原料,于暗处通氮气保护下合成了百草枯半抗原;混合酸酐法偶联大分子蛋白载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白（OVA）制备免疫抗原和包被抗原;免疫新西兰大白兔,制备多抗。结果:合成的半抗原经HPLCMS、1HNMR和IR鉴定,初步确定合成成功;百草枯半抗原与BSA和OVA的结合比分别为19∶1和14∶1;抗血清经间接ELISA法检测,效价达1

2、∶2.56×104,经饱和硫酸铵沉淀法纯化后抗体的效价达1∶5.12×104。结论:合成的百草枯人工抗原具有较好的免疫原性,为百草枯酶联免疫检测（ELISA）试剂盒的研制提供了基础。【关键词】百草枯;抗原;抗体;免疫检测百草枯（paraquat,PQ）又名克无踪、对草快,化学名为1,1’二甲基4,4’联吡啶阳离子盐,是一种广谱、灭生性有机杂环类除草剂［1］。百草枯可经胃肠道、皮肤和呼吸道吸收,易导致肺纤维化［2］。为了保护人类健康和环境安全,许多国家严格限制使用百草枯［3］。我国2005年发布并实施的国家标准

3、食品中最大农药残留限量中规定蔬菜、柑橘、小麦粉中百草枯的最大残留限量分别为0.05、0.2、0.5ppm。高效液相色谱分析法、气相色谱分析法等仪器分析法样本前处理及测定过程繁琐,费用高,不适于大量样本筛查。而酶联免疫吸附检测法（EnzymelinkedImmunosorbentassay,ELISA）灵敏度高,特异性强,仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点,适于现场监控和大量样本筛查。特异性抗体的制备是建立免疫分析法的必要前提。百草枯的相对分子质量(Mr)仅为257000,属于半抗原,而且自身没有可供偶联的活

4、性官能团（如氨基、羧基等）。本研究在前期工作中,选择百草枯结构类似物4,4’联吡啶,设计和合成了具有活性羧基的百草枯半抗原。我们采用混合酸酐法合成人工抗原,并进行结构鉴定,经免疫新西兰大白兔后,获得了较高效价的特异性多克隆抗体。1材料和方法1.1材料二噁烷、无水三正丁胺、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）均购自Sigma公司;氯甲酸异丁酯购自Fluka公司;弗氏完全、不完全佐剂购自北京生物制品研究所;四甲基联苯胺（TMB）、羊抗兔IgG购自北京博奥森有限公司;其他试剂均为分析纯。紫外可见光分光光度计Spe

5、ctronic1.70为意大利GBC公司产品;Nexus670型傅立叶变换红外光谱仪为Nicolet公司产品;酶标仪MK3购自上海智理科学仪器有限公司。1.2方法1.2.1混合酸酐法合成百草枯人工抗原（1）取前期合成的百草枯半抗原（PQh）16mg溶于600μL二噁烷中,搅拌使其溶解。然后加入无水三正丁胺70μL,将此混合物在4℃冰浴中冷却,并搅拌15min。加入重蒸的氯甲酸异丁酯30μL,4℃左右搅拌30min。（2）52mgBSA溶于4.5mL水中,用0.1mol/L的NaOH调pH至9.0。将上述PQh溶

6、液逐滴加入到溶解的蛋白中,并于4℃轻微搅拌4h,整个过程维持pH在9.0。然后,将混合物于4℃对0.1mol/LpH7.4的PBS中透析72h,每隔6h换透析液1次。冷冻干燥后于-20℃保存。用同样的方法合成包被抗原PQhOVA［5］。1.2.2百草枯人工抗原结构的鉴定所得的百草枯人工抗原采用Nexus670型傅立叶变换红外光谱仪(IR)鉴定结构。1.2.3人工抗原偶联比的测定（1）摩尔消光系数ε的测定。配制PQ浓度为0、0.01、0.02、0.03g/L的水溶液,通过紫外扫描可知PQ的最大吸收波长为260nm

7、,在260nm处测吸光值,每个浓度做平行样。摩尔消光系数ε＝吸光值/摩尔浓度。（2）人工抗原中蛋白质含量的测定。采用Bradford法测定人工抗原中蛋白质含量,以超纯水配制BSA浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1g/L,配制人工抗原浓度为1g/L,在波长为595nm下测定其吸光值,绘制CA曲线,并计算人工抗原中蛋白质含量［6］。（3）偶联比的测定。配制0.1g/LBSA的水溶液,将偶联产物用超纯水稀释到0.1g/L,在260nm处测吸光值,以超纯水为空白,吸光值为A1、A2。偶联比

8、率r为:r=［（A2－A1）/ε］/（0.1/65000）,其中ε为摩尔消光系数（L/mol）,65000为BSA分子量,0.1为BSA浓度（g/L）。1.2.4抗体的制备将合成的百草枯人工抗原（PQhBSA）免疫2只健康雄性新西兰大白兔（质量在2.0kg左右）。免疫前1周从耳缘静脉采血作阴性对照。称取1mgPQhBSA,用5mL0.1mol/L的P