雷公藤内酯醇人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

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1、雷公藤内酯醇人工抗原的合成及多克隆抗体的制备作者：唐波，刘晓，徐晓昱，姚其正，郑伟，华子春【摘要】用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定偶联效果，计算偶联率。利用免疫抗原免疫小鼠，制备小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性，为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础。【关键词】雷公藤内酯醇；14位羟基修饰；人工抗原；多克隆抗体雷公藤内酯醇（triptolide，TP）分子式C20

2、H24O6，分子结构如图1，相对分子质量360.41，为二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（TripterygiumA公司），cBSA（购自PIERCE公司），OVA，1乙基（3二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl），福氏完全佐剂（FCA）和福氏不完全佐剂(FIA)，6～8周龄BALB/c小鼠（购自扬州大学比较医学中心）,Sephadex凝胶柱（购自PIERCE）。TP、OVA、1乙基（3二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、福氏完全佐剂（FCA）和福氏不完全佐剂（FIA）均购自Sigma公司，cBSA、Sephadex凝胶

3、柱均购自PIERCE公司，6～8周龄BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心。岛津UV2550紫外可见分光光度计，EppendorfCentrifuge5415R离心机，TECANSAFIRE自动酶标仪。1.2TP14位羟基的修饰以及修饰产物的质谱鉴定将TP的14位羟基进行衍生化修饰，在弱碱性条件下和丁二酸酐进行酰化反应，反应式如图2所示，得到水溶性分子triptolide14succinate（mTP），用质谱鉴定反应产物。1.3TP人工抗原的制备碳二亚胺（EDC）法偶联mTP与蛋白载体（以cBSA为例，OVA合成的方法类似）：取5mgmTP和2.5mgc

4、BSA溶解在250μlTEbuffer（pH8.0）中，充分震荡使其溶解，再取EDC·HCl79mg充分溶解于250μlTEbuffer（pH8.0）中。将mTP和cBSA的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC溶液，在37℃摇床中反应2h以上。先用Sephadex柱分离偶联产物和未结合的mTP小分子，再透析纯化，将0.5ml溶液在PBS中透析3d，每天换液两次，每次换液200ml。透析产物小剂量分装，于－20℃保存备用。1.4人工合成抗原的紫外鉴定用紫外分光光度法对cBSA标准品、偶联产物和mTP进行紫外扫描，根据偶联产物最大吸收峰的位移判断是否偶联成功。1.5人工合

5、成抗原偶联率的计算紫外扫描结果显示，蛋白载体最大吸收峰的位置在280nm，mTP最大吸收峰在261nm，偶联产物这两个波长的紫外吸收强度包括了蛋白载体和mTP的贡献。人工合成抗原的摩尔偶联率CmTP/CBSA可由以下公式计算得出：CmTP/CBSA=(A280×KBSA，261－A261×KBSA，280)/(A261×KmTP，280－A280×KmTP，261)其中A280、A261分别为偶联产物在波长为280nm和261nm时的紫外吸光度，KBSA，280、KBSA，261、KmTP，280、KmTP，261分别对应BSA和mTP在波长为280nm和261

6、nm的摩尔消光系数［3］。1.6TP人工抗原多抗血清的制备及鉴定初次免疫：将100μg人工抗原与等体积FCA乳化完全，皮下分点注射4只BALB/c小鼠；2次免疫：初次免疫后两周将100μg人工抗原与等体积FIA乳化完全，皮下分点注射BALB/c小鼠；3次免疫：两周后将150μg人工抗原皮下分点注射BALB/c小鼠；第3次免疫两周后，以200μg人工抗原经腹腔加强免疫血清效价较高的小鼠。尾部采血分离抗血清，以制备的检测抗原OVAmTP包被ELISA板，采用间接ELISA法检测血清抗体的效价。为了验证血清中TP抗体的特异性反应，我们用偶联好的OVAmTP包被酶标

7、板，再用不同浓度的TP、雷公藤内酯三醇（图3）和冬凌草甲素（oridonin）间接竞争ELISA法检测血清中抗体特异性。以TP为例，竞争ELISA方法如下：取OVAmTP于37℃，2h包被酶标板（每孔100μl），10%羊血清封闭后PBST洗3次，每孔加入50μlTP，浓度分别为1、2、5、8、10、30、50ng·μl－1和50μl稀释的血清，混匀后37℃反应1h，PBST洗3次，加入酶标二抗37℃反应1h，洗3次，每孔加显色液150μl，反应15min，2mol·L－1硫酸终止反应后，用酶标仪测450nm吸收值，每孔测4次，取平均值，建立竞争抑制曲线。2结

8、果和讨论2.1mTP的质