制片、染色及显微观察

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1、食品微生物检验规范操作基础培训5制片、染色及显微观察福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室2010.05主要内容：§1清洗、消毒和灭菌操作§2培养基的制备§3采样和取、制样§4接种、分离纯化§5制片、染色及显微观察§6实验室安全基础知识5.1显微操作显微镜是微生物检验中最常用的精密光学仪器。显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。食品微生物检验中最常用的是普通光学显微镜。显微镜的使用方法用光学显微镜观察微生物形态时，一般遵循先低倍镜观察，后高倍镜观察，再油镜观察。低倍镜操作方法1.两眼从侧面注视低倍物镜对准通光孔

2、，使用粗调焦螺旋将镜筒自上而下的调节，避免物镜镜头接触到玻片而损坏镜头和压破玻片。当物镜镜头与载物台的玻片相距2～3mm时停止；2.左眼注视（注意右眼应该同时睁着），并转动粗调焦螺旋，使镜筒徐徐上升，直到看清物象为止；3.再用微调焦螺旋调至清晰。注意：粗调调焦螺旋只用于上调载物台，如观察显微镜时，用粗调节器调节，有压碎载玻片、损坏物镜的危险。因此，用细调焦螺旋调节视野使其更清晰高倍镜操作方法1.将低倍镜观察到的目标移动至视野中央；2.将低倍镜镜头转换成高倍镜镜头。换用高倍镜后，视野内亮度变暗，因此一般选用较大的光圈并使用反光镜的凹面；3.用微调焦螺旋调至清晰。观看的物体数目变少，但是体积变

3、大。注意：高倍镜观察时，光线需增强。油镜操作方法1.将高倍镜观察到的目标移动至视野中央；2.将高倍镜镜头挪开，于载玻片上滴一滴香柏油；3.将油镜镜头移动至视野，让油镜镜头浸入香柏油（至油晕不再扩大为止）；4.用微调焦螺旋调至清晰。注意：油镜的操作需要较强的关线，故需将光线调至最强。用10倍和/或40倍物镜为随后的高倍油镜（90倍或100倍）选择合适的视野（油镜镜筒上通常刻有H.I.OIL或OEL等标志）油镜用后的处理：第一遍：用擦镜纸拭去镜头上的油；第二遍：用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去头上残留的油迹；第三遍：再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。普通显微镜的保养(1)观察完后，

4、移去观察的载玻片标本。(2)用过油镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。(3)转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。(4)将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。镜头清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸，物镜的清洗，可选用不同的溶剂，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。§5.2制片和染色染色原理由于微生物细胞含有大量水分，机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,必须进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成

5、。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。细菌带负电荷多，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。微生物中细菌、致病菌是很小的生物体，必须通过染色的方法，在显微镜下才能看得清楚，并且还可以通过染色的方法鉴别革兰氏染色特性，以及是否长有鞭毛、周毛、荚膜和芽孢等。细菌的形态杆菌螺形菌球菌细菌的测量单位：微米(μm)细菌的大小与形态染色方法(一)简单染色法简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，观察细菌的形态。(二)复染色法用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别

6、不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G―表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。实验材料1.显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯、蜡笔等。2.草酸铵结晶紫染液、碘液、95％乙醇、蕃红染液、石炭酸复红染液3.菌株：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌实验内容与步骤(一)细菌的简单染色步骤涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检1．涂片取干净的载

7、玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量培养物与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。2．干燥涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。3．固定手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过