用于基因克隆的载体

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1、第三章用于基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征3.1载体的功能及特征3.1.1载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件3.1.2载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有较高的外源DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.2质粒载体3.2.1质粒的基本特征A:质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被

2、稳定遗传的一类核酸分子；B:质粒常见于原核细菌和真菌中；C:绝大多数的质粒是DNA型的；D:绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA；E:质粒DNA的分子量范围：1-300kb。双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一个裂口）线状双螺旋（两个裂口）3.2.2质粒的分子形式3.2.2.1共价闭合环状DNA（cccDNA)CovalentclosecircularDNA呈超螺旋（SC）（supercoil）3.2.2.3线形DNA（linear，L-DNA）一条链上有一至数个缺口。3.2.2.2开环DNA（opencircular

3、，ocDNA）同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、LDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL3.2.2.4质粒空间构型与电泳速率3.2.3质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型质粒1-3拷贝stringentplasmid松弛型质粒10-60拷贝stringentplasmid任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不

4、相容性群以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容3.2.4质粒的不相容性质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势两种含有不同复制子结构的质粒，复制时受各自拷贝数控制系统的调节，使两种质粒的最终拷贝数恒定，经过若干复制和细胞分裂周期后仍能共处同一细胞内。3.2.5质粒的可转移性革兰氏阴性

5、菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞，如F、Col、R质粒等非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定。大肠杆菌接合（conjunction）3.2.6携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有

6、重要意义3.2.7质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。pSC1018.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr3.2.7.1天然质粒的缺陷（1）分子量大，拷贝数低第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1kb。但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。（2）筛选标记不理想ColE1质

7、粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。3.2.7.2理想载体条件A、较小的分子和较高的拷贝数B、多个单一的限制性内切酶位点C、两种以上的选择标记D、易导入宿主细胞并复制和表达3.2.7.2质粒的选择标记及其工作原理：氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性（Tetr）链霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性

8、标记：i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）,青霉素的衍生