实时荧光定量PCR技术的操作实践

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1、第30卷第7期实验室研究与探索Vol．30No．72011年7月RESEARCHANDEXPLORATIONINLABORATORYJul．2011实时荧光定量PCR技术的操作实践杨怡姝，孙晓娜，王小利，沈思嗣，李泽琳，曾毅(北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京100124)摘要:采用Mx3000P型实时荧光定量PCR仪，以SYBRGreenI法相对定量技术为例，设计1例检测针对HIV-1vpr基因的特异性siRNA基因沉默效果的实验。介绍了实时荧光定量PCR技术上机前样本的制备过程、检测程序及相关参数的设置方法等操作流程;结合熔解曲线、扩增曲线进行结果分析;强调了实验整体设计、引

2、物设计与PCR反应体系的优化和内参的恰当选择在实时荧光定量PCR技术中的重要性。关键词:荧光定量PCR;SYBRGreenI;扩增曲线;熔解曲线中图分类号:G633．91文献标志码:A文章编号:1006－7167(2011)07－0015－05ExperimentalTeachingofReal-timeFluorescentQuantitativePCRYANGYi-shu，SUNXiao-na，WANGXiao-li，SHENSi-si，LIZe-lin，ZENGYi(DepartmentofLifeScienceandBioengineering，BeijingUniversit

3、yofTechnology，Beijing100124，China)Abstract:ThispapertakestherelativequantitativemethodofSYBRGreenIasanexample，designinganexperimetwhoseaimistodetectthegenesilencingeffectofHIV-1vprspecificsiRNAswithmodelMx3000Pinstrument．Howtopreparethesamplesandhowtosetupthedetectionprogramandparameterswerepres

4、ented．Theanalysismethodwasintroducedwiththeuseofdissociationcureandamplificationplots．Theimportanceofoverallexperimentdesign，primerdesign，theoptimizationofPCRreactionsystemandappropriatedinternalcontrolwasemphasized．Keywords:real-timefluorescentquantitativePCR;SYBRGreenI;amplificationplots;disso

5、ciationcurve［2］Higuchi等报道实时荧光定量PCR技术以来，因其0引言具有全封闭单管扩增、简便快速、重复性好、无扩增后处理步骤从而大大减少了扩增产物污染的可能性，并实时荧光定量PCR技术(Real-timeFluorescent［3］［4］［5］QuantitativePCR，RT-PCR/q-PCR)是20世纪末推出易于自动化等优点，使其在医学、食品、动植［6］［7］的一种新的核酸定量技术。在PCR反应体系中加入物、微生物学等领域中受到青睐，成为当今研究荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进基因表达水平、病原体鉴定等的最热门技术之一。为程，使每一个循环变得“可

6、见”，最后通过阈值循环数了让学生掌握实时荧光定量PCR技术，本文以(Thresholdcycle，Ct值)和标准曲线对样品中的DNASYBRGreenI法相对定量技术为例，设计了1例检［1］测针对HIV-1vpr基因的特异性siRNA基因沉默效果(或cDNA)的起始浓度进行定量。自从1993年，的教学实验。收稿日期:2010－12－141实验材料与仪器基金项目:国家重点基础研究发展(973)计划项目(2009CB930202);北京市教委科研项目(KM200810005015);北京市自材料:cDNA样本(为细胞共转染HIV-1vpr和/或然科学基金项目(5072003);北京工业大学

7、校青年基金项目siRNA表达质粒48h后，提取细胞总RNA，再经反转(X1015001201001)作者简介:杨怡姝(1974－)，女，黑龙江哈尔滨人，博士，副研究员，录获得的cDNA)、BrilliantSYBRGreenQPCR主要研究方向:病毒性疾病防治。MasterMix检测试剂盒。Tel．:010-67391668;E-mail:yishu-y@bjut．edu．cn仪器:Mx3000P实时荧光定量PCR仪(美国16实