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《KDR酪氨酸激酶的克隆表达及纯化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、生物工程学报ChinJBiotech2008,September25;24(9):1545-1549journals.im.ac.cnChineseJournalofBiotechnologyISSN1000-3061cjb@im.ac.cn©2008InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,Allrightsreserved研究报告KDR酪氨酸激酶的克隆表达及纯化刘春平,张洋,李元中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所,卫生部抗生素生物工程重点实验室,北京100050摘要:VEGF作为一种血管内皮细胞有丝分
2、裂原,通过与内皮细胞表面特定受体结合,从而导致新生血管的形成,其中VEGFR-2(KDR/Flk-1)在肿瘤血管形成中起重要作用,因此其抑制剂有可能发展成为治疗肿瘤的新药。采用大肠杆菌成功表达了具有酪氨酸激酶活性的KDR酪氨酸激酶催化域(KDR-CD)。采用RT-PCR从人脐静脉内皮细胞中提取总RNA,获得KDR-CD的编码基因,将其克隆至pET-30a载体,在E.coliBL21(DE3)中进行了成功表达,采用Ni-NTA亲和层析对其进行了纯化,Westernblotting结果显示表达的KDR-CD蛋白自身磷酸化,重组KDR-CD蛋白具
3、有利用ATP催化底物发生磷酸化反应的激酶活性。关键词:血管生成,KDR酪氨酸激酶,大肠杆菌,酪氨酸激酶活性Cloning,ExpressionandPurificationofKDRTyrosineKinaseChunpingLiu,YangZhang,andYuanLiKeyLaboratoryofBiotechnologyofAntibiotics,MinistryofHealth,InstituteofMedicinalBiotechnology;ChineseAcademyofMedicalScienceandPerkingUnio
4、nMedicalCollege,Beijing100050,ChinaAbstract:ThecatalyticdomainofKDRkinase(KDR-CD)wasamplifiedfromRNAofHUVCEscellswithRT-PCRandexpressedinE.coliBL21(DE3)byplasmidpET30aasvector.Therecombinantproteinwaspurifiedwithaffinitychromatography(Ni-NTA).Westernblottingshowedthatthere
5、combinantKDR-CDwasphosphorylatedinE.coliBL21(DE3).TherecombinantKDR-CDwasidentifiedtohavekinaseactivitycatalyzingthesubstratephosphorylatedwithATPintheenzymaticreaction.Keywords:angiogenesis,KDRtyrosinekinase,E.coli,kinaseactivity.血管生成(Angiogenesis)是毛细血管从已构建的通过和其特异性受体结合发挥作
6、用的,其中毛细血管网中以出芽方式新生的过程,参与许多生VEGFR-2(KDR/Flk-1)在调节内皮细胞增殖、分化反理和病理过程如胚胎发育、伤口愈合、糖尿病、关应中最为重要,是内皮细胞VEGF信号传导的主要[1]节炎、慢性炎症和肿瘤的发生及转移。血管内皮执行者。KDR主要在内皮细胞表达,由胞外7个Ig[6]生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)样结构域,一个跨膜域和胞内域组成。VEGF与作为血管内皮细胞特异的有丝分裂原,直接参与血KDR结合后受体二聚体化,进一步激发KDR酪氨管形成,促进内皮细胞
7、分裂增殖,促使新生血管形酸发生磷酸化,导致自身酶活性和下游信号相关酶[2−5][6−8]成,同时还能有效提高血管的通透性。VEGF是的激活,从而调节血管内皮细胞相关反应。新生Received:January14,2008;Accepted:March27,2008Supportedby:theChineseNational863HighTechnologyProgram(No.2004AA2Z3784).Correspondingauthor:YuanLi.Tel:+86-10-63153320;E-mail:yuanwli@263.net
8、国家高科技研究与发展计划项目(No.2004AA2Z3784)资助。1546ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechSeptember25,200
