藤黄微球菌rpf基因的克隆表达及纯化鉴定

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1、藤黄微球菌Rpf基因的克隆表达及纯化鉴定作者：樊爱琳，师长宏，苏明权，薛莹，柏银兰，马静，刘家云，张建芳，程晓东，郝晓柯【摘要】目的：克隆藤黄微球菌Rpf基因,序列测定正确后进行融合表达纯化.方法：采用聚合酶链反应(PCR)方法，从藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC19克隆载体中,测序正确后再亚克隆到融合表达载体pProEXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化.结果：获得藤黄微球菌Rpf基因,得到融合6个组氨酸残基的藤黄微球菌Rpf蛋

2、白,可溶性分析发现融合蛋白主要在包涵体中存在，最后在变性条件下，用Ni2+NTA亲和色谱柱纯化目的融合蛋白，纯化获得的融合蛋白纯度大于90%，ukamolova等［1］发现在MicrococcusLuteus（藤黄色微球菌）中发现了一种能促进细菌复苏生长的因子并命名为复活促进因子（Resuscitationpromotingfactor,Rpf）.Biketov等［2］发现Rpf可促进巨噬细胞内受损的休眠期的结核杆菌进入活化增殖状态,且还是宿主免疫系统识别的靶抗原.通过同源性分析发现结核分枝杆菌基因组可编码5种Rpf样蛋白［3］.我们拟克隆表达藤黄微球菌Rpf蛋白，进一步研究其生物学和

3、免疫学特性，以建立临床结核分枝杆菌的快速分离培养方法，并评价其是否可作为候选结核亚单位疫苗的组分.1材料和方法1.1材料藤黄微球菌标准株为西京医院检验科细菌室保存；TaqDNA聚合酶、dNTPs，T4连接酶、HindⅢ，BamHⅠ及DNA电泳胶回收试剂盒、质粒提取纯化试剂盒（Promega公司）；E.coliDH5α为本室保存，pProEXHT质粒为第四军医大学动物实验中心师长宏博士馈赠；金属鳌合亲和层析介质（NiNTA）（Qiagen公司）.1．2方法1.2.1引物设计登陆GenBank，根据藤黄微球菌Rpf基因序列(AC:Z96935)设计引物.P1：5′CGAGGATCCAC

4、CATGGACACCATGACTCTCTTCAC3′含BamHⅠ酶切位点p2：5′TCAAAGCTTTCAGGCCTGCGGCAGGACGAGCTCCT3′含HindⅢ酶切位点和终止码.扩增片段为697bp，由TaKaRa公司合成.1.2.2藤黄微球菌基因组DNA提取刮取适量藤黄微球菌落，TE(pH8.0)洗涤后重悬，加SDS至终浓度为10g/L，蛋白酶K至终浓度0.1g/L，55～60℃水浴过夜，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次，上层水相加2.5倍预冷的无水乙醇，1/10体积的3mol/L乙酸钠后置-20℃冰浴1h沉淀DNA，用无水

5、乙醇、700mL/L乙醇先后洗涤沉淀2次，抽干后溶于适量无菌水中.1.2.3藤黄微球菌Rpf基因的扩增、克隆及测序以藤黄微球菌基因组为模板，以P1和P2为引物，扩增目的基因.PCR反应条件：94℃60s，52℃60s，72℃90s，共30个循环，再于72℃延伸7min.回收PCR产物，经BamHⅠ和HindⅢ消化后，然后用T4连接酶连接入经同样酶消化的pUC19中，转化E.coliDH5α感受态细胞.然后涂布于LB平板（含氨苄青霉素100mg/L），随机筛选4个菌落，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，提取质粒DNA，用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，37℃过夜

6、，进行10g/L的琼脂糖凝胶电泳，以DL2000为分子质量参照，观察有无约697bp大小的片段，将阳性克隆命名为pUC19Rpf,然后随机挑取3个克隆进行测序.1.2.4重组质粒表达提取测序正确的重组克隆质粒，经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后，回收目的基因条带，溶于50μL双蒸水中.取目的片段和同样用HindⅢ和BamHⅠ双酶切的pProEXHT质粒以3∶1的比例混合，用T4连接酶连接，转化E.coliDH5α感受态细胞.然后涂布于LB平板（含氨苄青霉素100mg/L），37℃培养过夜.随机挑取2个菌落，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜.各取1.5mL提取

7、质粒DNA，再以HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定，挑选阳性克隆.挑取1个阳性克隆接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养18h，取100μL加到10mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养2～3h，以终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导4h，取1mL诱导表达菌液以及未诱导的菌液离心，回收菌体沉淀.将诱导前后的样本重悬到去离子水中，加入2×样品缓冲液，100℃沸水浴5min，12000g离心10mi