细胞化学与组织化学

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1、组织化学技术序言现代组织化学是介于细胞生物学、组织学、生物化学及分子生物学之间的一门新兴边缘学科，它已渗透和应用于生命科学的许多领域。近几十年来，组织化学发展突飞猛进，日新月异，已产生了许多分支，各类分支虽有特点，但都源于组织化学。因此，组织化学已成为医学生物学科研过程中必备知识之一。组织化学（histochemistry）/细胞化学(cytochemistry)是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、定位和定量研究的科学。主要研究对象是生物大分子(如核酸、蛋白质、酶、多糖和脂类等)在细胞内的结构和功能活动中的分布与变

2、化以及亚细胞组分和细胞器在整个生命活动中的作用等。一、组织化学发展简史组织化学是在组织学和化学的基础上发展起来的，早在十九世纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开始观察组织中的化学反应，解释生物界中的生理现象。(1890一1920)随着显微镜的改进和组织细胞学染色技术的发展，组织细胞化学开始从生理组织学的概念转为显微化学。依赖细胞内的某些酶催化特异底物的化学反应形成酶细胞化学。70年代由于细胞显微分光光度法和荧光显微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量，形成了定量细胞化学。80年代电镜细胞化学可以观察化学成分的亚细胞定位。80～90年代，先后流式细胞术、激光扫描共聚焦显微技术出现。

3、激光扫描共聚焦显微技术，相似于对单个细胞进行细胞“CT”分析，并能研究活细胞和定量分析细胞内的遗传物质DNA、RNA、细胞器的酶含量，细胞内各种荧光标记物(包括分子和离子的浓度及其分布，如Ca2+和pH值等)，流式细胞术是一种快速对单细胞化学成分定量分析的新技术，每秒可测上万细胞信息，从一个细胞中，可同时测量多种参数。二、组织化学技术的基本要求1．尽可能地保持组织和细胞生前的形态结构、化学成分和酶的活性。必须选择适当的固定液和恰当的处理方法。2．化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物不移位，不弥散。3．反应物须有显色性和定量的可能

4、性，即必须是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关系。4．反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。5．反应物有灵敏性和特异性，以利于对比观察。6．反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。三、细胞化学技术显示的化学成分：蛋白质：显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基；RNA和DNA；糖类：如糖原、粘多糖和糖脂等；脂类：如中性脂肪、磷脂和胆固醇等；酶：包括水解酶(如磷酸酶、酯酶、肽酶)、氧化酶(琥珀酸脱氢酶、过氧化酶、细胞色素氧化酶)和激酶、转移酶等；生物胺：5-羟色胺、肾上腺素类、组织胺等；特异抗原：其

5、化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等；无机盐和微量元素：如铁、铜、锌、钴、镁等。四、细胞化学染色的原理：细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成在显微镜下可见到的反应产物。常用组织化学方法的原理如下：一）金属-金属盐沉淀反应原理利用金、银、铜、铁、铝、钴等金属化合物在与细胞化学成份反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质。如磷酸酶分解磷酸底物后，可与铅/钴形成磷酸铅，在硫存在时形成PbS或CoS的棕黑色沉淀，从而标出酶所在部位。二）偶氮偶联法原理用人工合成的酶底物，在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联反应，而形成不溶性的偶氮色素。α萘基磷酸钠磷酸氢

6、二钠＋α萘酚α萘酚＋FASTBLUE偶氮染料↓碱性磷酸酶＋水三）过碘酸Schiff氏剂反应法原理利用细胞中多糖放出的醛基可将Schiff氏剂中的无色品红转变为紫红色化合物，可于显微镜下观察到。这种反应多用于显示细胞中的糖类和细胞核内的DNA，前者称为PAS反应，后者称为Feulgen反应。此外，还可用于检查细跑中的粘蛋白和不饱和脂类。四）联苯胺法原理过氧化氢酶分解H2O2产生新生氧，后者可将无色联苯胺氧化，生成联苯胺蓝，进而变成棕黑色化合物。此法主要显示细胞中的过氧化物酶。五）色素形成法原理是一组显示酶定位的常用方法，其原理是在酶的作用下，使无色的化学物质在细胞局部形成色素沉着，以此

7、确定待测酶的存在部位。色素形成法主要包括四唑盐法（NBT、MTT）、靛蓝形成法等。其中四唑盐法用于定性各种氧化还原酶、多种脱氢酶、转移酶。靛蓝反应用于酯酶、磷酸酶等六）底物标记法原理底物标记法是指用同位素、色素、金属标记酶的底物，在酶的作用下，底物分解后沉着于酶所在的部位。最常用的底物标记法为放射自显影术，即70年代后兴起的同位素标记技术，其原理是用同位素标记底物，在酶的作用下，带有标记的分解产物沉着于酶所在组织结构上，通过放射自显影过程对沉着于酶所在部位