CR技术及其延伸与应用

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1、PCR技术及其延伸与应用刘红亮05.03.08聚合酶链反应或多聚酶链反(PolymeraseChainReaction,PCR）又称无细胞克隆技术(“freebacteria”cloningtechnique)特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107～108倍，大大提高了DNA的得率。PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室KaryMullis及同事于1985年发现并研制成功的；最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于β-珠蛋

2、白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。使用1976年Chien等分离的热稳定性TaqDNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可能；1987年KaryMullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。PCR已获得广泛应用,目前，每年都有上千篇文章发表。1991年，期刊“PCR方法与应用”（PCRMethodsandApplication）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。KaryMullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。(一名加拿大籍英国

3、科学家MichaelSmith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与Mullis同享此荣)瑞典皇家科学院说：“PCR方法已经广泛应用于生物医学中,该方法同DNA测序法结合起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工具。”现在世界各地都在使用PCR检测病人血液中的微量遗传物质，这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。PCR技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子生物学各有关学科的研究，使其达到一个新的高度。PCR的基本原理和基本程序变性:先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷

4、酸单链，退火:加入上下游引物，与互补链杂交复性。延伸:在TaqDNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5‘到3’方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。循环扩增每次循环使延伸的模板增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。预变性十分钟延伸保存PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。平台效应靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物—模板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱

5、和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应PCR的特点特异性高-聚合酶首次报导用大肠杆菌的DNAPolymeraseI的Klenow大片段。90℃会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入；同时引物是在37℃延伸TaqDNA聚合酶1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的，扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一高度敏感：理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上。应用证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100

6、万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。快速简便可扩增RNA或cDNA试剂引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物。耐热的DNA聚合酶：10×PCR缓冲液500mmol/lKCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/LMgCl2,1mg/ml明胶。dNTP贮备液DNA模板操作程序试剂混合PCR仪程序设计：94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35

7、次。最后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。PCR反应基本条件及其对PCR的影响模板核酸有机溶剂－酚蛋白质污染核酸污染核酸的量引物引物与PCR的特异性，引物限定扩增产物的大小。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。冻干引物于-20℃至少保存12-24个月，液体状态于-20℃可保存6个月。引物不用时应存于-20℃保存。缓冲液缓冲液的目的：给TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/LTris-HCl(Tris是

8、一种双极性离子缓冲液，pH变化于6.8-7.8之间。将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。50mmol/L以内的KCl，50mmol/L以上的KCl则抑制TaqDNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+。反应中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明胶（0.01%）或Tween20（0.05%～0.1%）5mmol/l的二硫苏糖醇（DT