CR技术原理及其应用-刘晓雪

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1、第二章PCR技术原理及其应用第一节PCR技术原理PCR(PolymeraseChainReaction)聚合链式反应Threesteps:denaturation,primerannealing,polymerization.PeoplesChoiceReaction一、PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的

2、发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTG

3、CGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明1971年，Khorana美国MIT教授、1968年诺贝尔医学奖得主提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……8KaryMullis(1985)发明过程Mullis在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的

4、方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。发展过程：开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PC

5、R能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryB.Mullis<>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段12专利官司1987年美国专利局专利授权1989年，DuPont异议，大

6、小公司对簿公堂，将决定谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus。Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂和仪器。13根据ABI（美国应用生物系统公司）和Roche（罗氏）的

7、协议，PCR专利可分为方法专利和仪器专利，ABI得到仪器专利，Roche掌握方法专利。在应用领域，Roche的势力范围是诊断、亲子鉴定、兽医；ABI争到的领地包括研发，质控、法医、环境、农业等。对于科研人员来说，主要关注的是科研领域－－也就是ABI的领地。PCR专利意味着什么？所有科研用途的仪器或者试剂的生产商在生产销售PCR相关产品时需要上缴专利使用费给ABI，ABI平均每年获得的5千万美元PCR专利版税的来源。TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010

8、01008060402072℃94℃55℃PCR循环二、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。P