《DNA和质粒抽提》PPT课件

《《DNA和质粒抽提》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、DNA抽取和质粒DNA制备第一部分DNA提取总论一、提取DNA总的原则：1保证核酸一级结构的完整性；2其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；3核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。二、样本来源：理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取DNA样本选择取决于试验目的全血是基因组提取最常见的样本血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆（血清）标本占分子诊断的60%以上DNA提取前样本采集、预处理和保存：（一

2、）全血1.抗凝剂EDTA-Na2或枸橼酸钠作为抗凝剂不宜使用肝素抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80℃保存2个月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差mRNA逆转录后RT-PCR结果（0、3、6个月）ABCD（二）血浆和血清血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检测中血浆DNA又称为循环DNA，是一种无细胞状态的胞外DNA，主要是游离的单链、双链DNA或DNA-蛋白质

3、的混合物它在未来分子诊断的应用中具有广阔前景血浆DNA成分的来源分为内源性和外源性两个部分，其中入侵的病毒、细菌等病原体释放入血液的核酸是外源性血浆DNA最重要的成分血浆DNA内源性循环DNA外源性循环DNA自身基因组来源DNA入侵的病毒、细菌等病原体死亡细胞活细胞释放（三）体液尿液、胸水、腹水和脑脊液等标本离心后取沉淀提取体液中细胞的核酸对释放入体液中的病毒或细菌的游离核酸，采用超高速离心或体液浓缩后再提取核酸（四）分泌物（以痰液为例）痰液是检测呼吸道病原体核酸的主要样本，深部咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前应先漱口，以避免混入大量的口腔脱落的上皮细胞和唾液等影响检

4、测结果结核分枝杆菌的检测，可以用NaOH液化痰液去除粘液和蛋白质；非结核分枝杆菌的核酸，使用生理盐水后取上清液痰液检测病原体核酸不适宜作定量分析，检测时尽可能提高痰液中细胞成分的回收率三、DNA的收率样本类型基因组DNA收率20mg肝脏组织8g100mg豆苗10g100l全血2g2106培养细胞10g四、DNA提取的基本步骤1、核酸的释放：破裂细胞释放核酸机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应最广泛的方法）各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法应用Ⅰ机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母Ⅱ物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌

5、、病毒4低渗裂解红细胞Ⅲ化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母破裂细胞、释放核酸2、核酸的分离与纯化：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤4、DNA鉴定DNA的鉴定浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定浓度鉴定1）紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。如计算DNA浓度A260×稀释倍数×50＝μg/ml紫

6、外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1时，相当于50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA或RNA，20μg/ml单链寡核苷酸）各种碱基的紫外吸收光谱2）荧光光度法荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）EB与DNA的结合500l全血提取的基因组DNA电泳动物组织提取基因组DNA纯度鉴定紫外分光光度法：在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。A260与A280之比应在

7、1.80；纯的RNAA260与A280之比应在2.0。A260/A280比值是纯度检测的重要指标。完整性鉴定凝胶电泳法：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。5、核酸的贮存——DNA保存1）短期贮存：4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。2）长期贮存