碱裂解法抽提质粒DNA.doc

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1、实验一 碱裂解法抽提质粒DNA[实验原理]    质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，大小在1-200kb之间，能在宿主菌中自主复制。宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。    质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（氨苄青霉素、四环素等抗性），利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。    质粒作为基因工程载体必须具备以下条件（1）复制子（o

2、ri）：一段具有特殊结构的DNA序列；（2）有一个或多个便于检测的遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；（3）有一个或几个限制性内切酶位点，便于外源基因片段的插入；（4）适当的拷贝数。制备质粒载体是分子生物学的常规技术。    碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。   纯化质粒DNA

3、的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。[实验目的]1、 掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理和方法。2、 掌握紫外吸收光谱法测定核酸含量的原理和方法。[

4、实验步骤]1、试剂配制（1）LB培养液10gTryptone，5gYeastExtract，10gNaCl，双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。（2）LB平板培养基在LB液体培养基中加入琼脂粉15g，高压灭菌，冷却至45℃左右时倒平皿，4℃保存。（3）LA平板培养基待LB液体培养基冷却至45℃左右加入Amp(100μg/mL)，摇匀后倒平皿，4℃保存。（4）溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0),配制200

5、ml。取葡萄糖（C6H12O6.H2O）1.982g，双蒸去离子水160ml，0.5mol/LEDTA4ml，1mol/LTris-HCl(pH8.0)5ml，定容至200ml，高压灭菌后4℃保存。（5）溶液II：0.2mol/LNaOH,1%SDS。配制100ml，现用现配。10mol/LNaOH2ml，双蒸去离子水80ml，10%SDS10ml，最后用双蒸去离子水定容至100ml，室温保存。（6）溶液III：配制100ml。5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，双蒸去离子水28.5

6、ml。（7）5mol/L乙酸钾（200ml）乙酸钾98.14g，溶解于160ml双蒸去离子水中，搅拌溶解后定容至200ml。（8）3mol/L乙酸钠（NaAc）（pH5.2)    取乙酸钠（CH3COONa.3H2O)204.1g，溶解于200ml双蒸去离子水中，用冰乙酸调pH5.2，双蒸去离子水定容至500ml，高压灭菌后4℃保存。（9）10mol/LNaOH溶液（100ml）    NaOH晶体40g，加水至100ml。（10）10%SDS    称取SDS10g，溶解于80ml水中，68

7、℃助溶，加数滴1mol/LHCl调pH7.2,定容至100ml。（11）0.5mol/LEDTA（pH8.0)（100ml）。    Na2EDTA.2H2O18.61g,H2O70ml，边搅拌边加入NaOH固体调节pH，接近pH8.0时才充分溶解，大约需NaOH2g。最后加水至100ml。（12）TE缓冲液（pH8.0）（100ml）    10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。2、细菌的培养（1）配制LB液体，在琼脂糖平板培养基上划线培养出单菌

8、落（37℃，16-20小时）。（2）在灭菌过的10ml玻璃培养管中加入3mlLA液体培养基、以及3微升Amp(100ug/ml)，挑取单菌落至培养基中。将培养管置于摇床中，３７℃振摇过夜(200-250rpm,16-18小时)。3、质粒的提取（1）吸取1.5毫升菌液至1.5mlEppendorf离心管中，3000rpm离心3分钟，弃上清液。（2）加上1.5毫升菌液，重复操作（１）。（3）用移液器尽可能除去上清液，加入150微升溶液Ｉ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。（4）加入250微升溶液Ⅱ,缓慢地上