《分子克隆》课件

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1、基因工程GeneticEngineering李黄金Email:lihuangjin@sohu.com生命科学与生物制药学院２００9基因工程课程内容523416789基因工程概论分子克隆单元操作大肠杆菌基因工程非肠道细菌基因工程真菌基因工程昆虫基因工程高等动物基因工程高等植物基因工程蛋白质工程、途径工程第二章分子克隆单元操作2.22.32.1用于基因克隆的载体DNA的体外重组（切与接）目的基因的克隆2.4基因操作常用技术转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.52.62.1用于基因

2、克隆的载体质粒载体噬菌体或病毒载体考斯质粒与噬菌粒人工染色体载体载体的基本概念重要的噬菌粒载体：pUC118/119pUC118pUC18+M13间隔区IGpUC119pUC19+M13间隔区IG500个拷贝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13辅助噬菌体DNA滚环复制重要的噬菌粒载体：pBluescript（体外转录载体）pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripB

3、luescriptPT3噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录提取出来的单链DNA重组分子在噬菌体RNA聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录四、人工染色体载体人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成人工染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并

4、遗传。目前常用的人造染色体载体包括：细菌人工染色体（BAC）酵母人工染色体（YAC）酵母人工染色体（YeastArtificialChromosomes,YAC）YAC载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列：TELpYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的复制顺序：ARS酵母染色体的中心粒序列：CEN酵母系统选择标记：URA3/TRP1大肠杆菌的复制子:ori大肠杆菌的选择标记:ApYAC载体的装载量为350-400kb酵母人工染色体的使

5、用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI连接转化酵母菌重组酵母染色体易于发生重组、缺乏稳定性、制备工艺繁琐细菌人工染色体（BacterialArtificialChromosomesBAC）细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300kb之间各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（genecluster）结构构建动植物基因文库

6、细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）优点：能携带大片段DNA，约300kb保留了与F因子的自主复制、拷贝数控制以及质粒分配等基本功能相关的基因2.1用于基因克隆的载体质粒载体噬菌体或病毒载体考斯质粒人工染色体载体几类载体的比较噬菌粒复制顺序：种类及其对应宿主选择标记：种类及其对应宿主容量（载量）：用途：第二章分子克隆单元操作2.22.32.1克隆载体DNA的体外重组（切与接）目的基因的克隆2.4基因操作常用技术转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组

7、子的鉴定（检）2.52.6基因工程的操作过程切接转增检2.2DNA的体外重组（切、接）三、其他用于DNA重组的工具酶二、T4DNA链接酶一、限制性核酸内切酶四、DNA体外重组操作1、限制性核酸内切酶的功能与类型细菌的限制与修饰作用：λK/K株；λB/Ｂ株hsdR：编码限制性核酸内切酶hsdM：编码限制性甲基化酶hsdS：负责限制性酶和甲基化酶的协同表达1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出2种限切酶：HindII和HindIII限制外来DNA（酶切），修饰自身DNA（甲基化保护

8、）一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease)限制性核酸内切酶的类型主要特性I型II型III型功能限切/修饰限切蛋白结构异源三聚体单体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内距识别序列下游24-26bp处用于DNA重组限切/修饰2、II型限制性核酸内切酶识别序列为4-6碱基对的回文对称结构是DNA重组中最常用工具酶识别、并切割双链D