《分子诊断与临床》PPT课件

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1、分子诊断与临床主要内容概述分子诊断的常用技术分子诊断在临床的应用分子诊断在应用中的问题及对策分子诊断的发展方向检验医学临床基础检验学临床生化检验学临床免疫检验学临床微生物检验学临床血液检验学临床寄生虫学临床分子诊断学(基因诊断=PCR?)科研平台？分子诊断学以分子生物学理论为基础利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性的生物大分子（如DNA、RNA和蛋白）和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据检验医学的分支学科之一分子诊断学的研究对象生物大分子核酸：DNA、RNA蛋白大

2、分子体系基因细胞组织临床学诊断细胞核DNA转录翻译mRNA蛋白质血清学诊断分子诊断生化学诊断临床表现细胞膜不同诊断方法的研究对象分子诊断的策略遵循实验诊断学的基本原则不同疾病及病因采用不同方法根据检测目的开展不同层次的检测注重环境基因组学研究成果发挥在耐药性方面的潜在作用在疾病预测、健康检查、个体化治疗中的作用关注分子诊断中的医学论理和生物安全问题开发简便、快速、准确、特异、灵敏的方法二、分子诊断的主要技术低通量技术DNA分析：Southernblot、PCR、RFLP、ASO、SSCP、DGGE、DHPLC、DNA含量测定染色体分

3、析：FISH、CGHRNA分析：ISH、Northernblot、RT-PCR蛋白质分析：IHC、Westernblot高通量技术核酸测序技术—基因诊断的金标准生物芯片(基因芯片)技术蛋白质组学技术2-DE质谱技术：MALDI-TOF组织芯片蛋白质组信息学RLFP原理FISH[NTERT-1与人着丝粒DNA片段杂交（绿），与人端粒DNA片段杂交（红）]二、几种常用的分子诊断技术核酸扩增分子克隆核酸分子杂交DNA测序单核苷酸多态性分析技术生物芯片技术蛋白质组学技术生物信息学1、PCR体外核酸扩增生物技术领域最重要四项技术之一细胞整合技

4、术分子克隆技术蛋白工程技术模板DNA94℃变性55℃退火72℃引物延伸第二次循环模板变性退火延伸经25-30次循环，目的DNA增加106-7PCR原理示意图2、分子克隆（基因克隆，基因重组）基本步骤分切接转筛含重组子的阳性克隆DNA重组体连载体+目的基因转化、筛选和鉴定阳性克隆+受体细胞全基因分切筛转3、核酸分子杂交定义不同来源的、具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下通过碱基配对原则形成双链的过程分子杂交技术的理论基础DNA（RNA）的变性与复性核酸分子杂交基本类型Southern杂交-----待测核酸是DNA片段Northern

5、杂交-----待测核酸是RNA片段衍生类型：斑点杂交、原位杂交等Southernblot操作流程斑点杂交示意图4、DNA测序已知序列的验证性测序策略未知序列的从头测序策略随机测序法（鸟枪法、人工转座子法）定向测序法（引物测序法、互套缺失法）全基因组测序策略DNA测序常用技术链末端终止法（Sanger法）化学降解法测序新技术MALDI-TOFMS杂交测序法焦磷酸测序技术原子探针显微镜法单分子测序技术自动化测序---常规应用链末端终止法测序原理化学降解法测序原理自动化测序充分体现DNA序列自动化分析技术的简单、安全、精确、并行和高效等特

6、点目前，自动化测序已成为DNA序列分析的主流，几乎完全取代了手工测序类型：基于单一荧光染料标记的自动化测序系统基于多种荧光染料标记的自动化测序系统单荧光多荧光（四荧光）377型DNA全自动测序仪5、单核苷酸多态性分析技术SNP：第三代遗传标志，是决定人类疾病易感性和药物反应差异性的主要因素SNP检测技术基本步骤靶序列的扩增SNP特异位点的区分方法：杂交、PCR、分子构象、酶法等数据的检测分析方法：凝胶电泳、荧光检测、基因芯片、质谱分析等主要的SNP检测方法凝胶电泳分析技术SSCP、TTGE、TGGE、DGGE分子杂交技术ASO、DA

7、SH、PNA杂交、LNA杂交荧光共振能量转移Taqman探针技术、分子信标技术、蝎状探针技术、替代探针技术PCR-SSCP6、生物芯片技术技术的核心：杂交技术实质：分子生物间特异性相互作用（互补配对）步骤：已知物质点样（阵列）加标记的待测样品，杂交检测数据分析、处理优点：高度并行性、多样化、自动化、微型化缺点：只能检测已知的大分子不能发现未知的大分子应用核酸分析（基因表达分析、基因突变检测、基因测序、基因图谱制作、多态性分析）、药物研究、蛋白质组鉴定及微生物菌种鉴定主要类型基因（DNA）芯片RNA芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片芯片实

8、验室(Lab-on-a-chip)6400点的基因芯片（面积12×14mm)7、蛋白质组学蛋白质组：一个细胞或一个组织或一个机体的基因所表达的全部蛋白质。蛋白质组学：从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态