《分子诊断项目》PPT课件

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1、分子诊断室项目介绍内容1.HBV-DNA荧光定量PCR2.流式基本应用3.染色体核型分析HBVDNA荧光定量PCRPCR技术简介1985年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室mullis等人发明了具有划时代意义的PCR技术，从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。1988年PE-cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，从而使PCR技术的自动化成为现实。Mullis出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变的发明者Michael分享了1993年诺贝尔化学奖。随着PCR技术的日臻成熟1995年出现荧光基因探针杂交定量PCR方法4PCR基本原理类似DNA的体内复制，以单

2、链DNA为模板，利用DNA聚合酶依赖于模板的特性，在附加的一对寡核苷酸引物之间催化合成互补链的过程。5DNA合成的必备要素DNAPolymerasedNTPssingle-strandedtemplateprimer6定量PCR概念以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量的定量7常规PCR与定量PCR的比较8实时荧光定量PCR原理指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。Ct（cyclethreshold)值定义：每个反应管的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。荧

3、光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10×SDcycle0-159Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。10荧光定量的标准曲线标准曲线未知标本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target3811荧光检测模式（1）SYBRGreenI染料（2）水解探针（

4、Taqman）（3）杂交探针（HybridizationProbes）（4）分子信标（molecularbeacon)发夹引物（sunriseprimer)蝎状引物（scorpionprimer)复合探针（complexprobes)12探针的5'端标记一个荧光基团，3'标记另一个荧光基团。5'端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团（FRET），正常情况下检测不到该探针5'端荧光基团发出的荧光信号。Taqman探针原理13当溶液中模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，Taq酶沿模板向前合成子链，当延伸至探针结合处，发生链的置换；Taq

5、man探针原理14Taqman探针原理Taq酶的5‘—3’外切酶活性将探针5‘端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽，发出荧光，荧光信号与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。15定量PCR在乙肝检测中意义1.判断疾病的严重程度和传染性2.PCR结果与血清免疫学结果的综合评价3.观察抗病毒药物疗效，指导药物用量4.献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断5.预测病情、判断预后6.器官移植、母婴垂直传播1617标本留取及检测步骤标本：静脉血3ml，黄色盖试管。标本避免溶血和脂血。检测步骤：1.反应

6、液配制2.核酸提取3.核酸扩增结果分析：采用样点拟合法，由标准曲线得到病毒的拷贝或IU/ML。181.分区操作：PCR具有超敏感性，因此在检测过程中应分区操作，即分为试剂准备区，样品处理区，PCR扩增区。2.试验前实验室应使用紫外消毒至少30分钟。3.操作时戴一次性手套，加样头要求及时更换，吸液时避免飞溅。注意事项194.每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，实验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。5.所有试剂试验前充分融化，避免反复冻融。6.每次PCR反应均应设立阴阳性对照。注意事项20流式基本应用流式细胞术的概念流式细胞术（FlowCytometr

7、y,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征22流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体23散射光信号RightAngleLightDet