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水中微生物检测的全球领导者叶卫军 电话：13929538576Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 水中微生物检测（新国标方法）总大肠菌群/大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群固定底物技术酶底物法介绍Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 总大肠菌群/大肠埃希氏菌 及耐热(粪)大肠菌群固定底物技术酶底物法Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 微生物检测的重要性地震等自然灾害过后水体中会被大量微生物所污染，特别是粪便污染，如水体中含有肠道病原菌株，并被人饮用则会爆发严重疾病如泌尿系感染、菌血症和脑膜炎，少数肠道病原菌株可引起急性腹泻。通常人们用投放含氯消毒剂进行消毒，但消毒效果如何还需要通过检测水体中是否含有总大肠菌群和大肠埃希氏菌来判断。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 指示菌的方法学定义总大肠菌群（TotalColiforms)大肠菌群系指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，具有指标菌的一般特征故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量。耐热大肠菌群(ThermotolerantColiforms)，原名：粪大肠菌群（FecalColiforms)用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群。是水体受人畜粪便污染的比较直接指标。大肠埃希氏菌（大肠杆菌，E.Coli.)大肠埃希氏菌是指能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，能产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的细菌。大肠埃希氏菌是粪大肠菌群的组成部分，是水体受人畜粪便污染的最直接指标，水中含有大肠埃希氏菌提示有粪便污染。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 背景知识大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌耐热大肠菌群大肠埃希氏菌大肠菌群Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 目前的粪大肠菌群检测方法是实际上是检测耐热大肠菌群而不是大肠埃希氏菌。 有关文献报道的试验结果表明,有15%的阳性耐热粪大肠菌群实际上属于总大肠菌群而不是大肠埃希氏菌。这种情况的发生多数是由于耐热的克雷伯氏菌普遍存在于自然环境中，而非来源于人畜粪便，因此与人类疾病的产生也没有绝对的关联。 同时，（用上述方法检测）会有10%的假阴性结果，是因为大肠埃希氏菌属有10％不会产气（注1）。注1：目前的粪大肠菌群检测方法，产酸产气是预试验的阳性判断指标。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 粪便污染指示菌比较总大肠菌群耐热(粪)大肠菌群大肠埃希氏菌肠球菌亚硫酸盐还原菌包含菌属埃希氏菌属、柠檬酸菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属（也包括沙雷菌属和哈夫尼亚菌属）主要是埃希氏菌属和耐热克雷伯菌属大肠埃希氏菌粪肠球菌、屎肠球菌、耐久肠球菌和海氏肠球菌等亚硫酸盐还原菌来源可来自人畜粪便，环境中自然存在主要来自于温血动物粪便，也可来自环境主要来自温血动物和人的粪便主要来自温血动物和人的粪便主要来自温血动物和人的粪便作为粪便污染指示菌的意义水处理的指示菌,不能作为消毒效果的指示菌比较直接的指示菌指示粪便污染的最理想指标、作为消毒效果的指示菌用于输配水系统维修后或新输配水管线铺设后水质的检测、用于饮用水中大肠杆菌检测有争议的粪致病菌指标为间歇性粪便污染的指标、过滤效果评价的指标Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 我国水质微生物指标(细菌)标准指标菌检测量GB5749-2006,生活饮用水标准菌落总数,总大肠菌群,大肠埃希氏或菌耐热大肠菌菌落总数:1ml;大肠菌100mlCJ/T206—2005城市供水水质标准细菌总数,总大肠菌群、耐热大肠菌细菌总数1ml,总大肠菌群/耐热大肠菌群:100mlGB3838-2002,地表水环境质量标准粪(耐热)大肠菌群1LGB/T14848-93地下水质量标准 GB9667-1996,游泳场所卫生标准细菌总数、总大肠菌群细菌总数1ml;总大肠菌群1LEvaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 检测方法多管发酵法（MultipleTubeFermentation,MTF)滤膜法（MembraneFiltration,MF)固定底物技术酶底物法(DefinedSubstrateTechnology,DST)酶底物法(EnzymeSubstrateTest,EST)Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 检测方法多管发酵法（MTF）–共需3-5天时间以100mL水样中大肠菌最可能数(mostprobablenumber,MPN)表示培养基制备>试管培养（22－26小时）阴性结果（无产酸，产气）产酸，产气平板培养18－24小时革兰氏染色，镜检观察菌落形态，挑取特征菌落证实试验（培养24±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在）Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 检测方法滤膜法（membranefiltration,MF)—共需2-3天时间用孔径为0.45μｍ的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数,计数单位为菌落形成单位CFU(colonyformingunit)储备培养基的制备>过滤（需器械灭菌等）>培养（22-24H）阴性结果(无典型菌落）革兰氏染色镜检观察菌落形态,挑取特征菌落证实试验（培养24±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在）Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 酶底物法总大肠菌群阳性反应原理β-半乳糖醛苷β-半乳糖苷酶Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 酶底物法大肠埃希氏菌阳性反应原理β-葡萄糖醛酸酶4-甲基-伞形葡萄糖苷酸Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 1,方法本标准方法采用固定底物技术酶底物法DefinedSubstrateTechnology,DST2，培养基：采用MinimalMediumONPG-MUG，简称MMO-MUG培养基3,优点假阳性,假阴性底操作简单,快速定性,定量（51孔/97孔定量盘法）50多个国家和组织认证世界卫生组织WHO,美国EPA,水与废水标准检验法…….《生活饮用水标准检验方法》对酶底物法定义Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 科立得应用饮用水源水瓶装水再生水废水食品水畜牧用水医疗用水收录于“标准测试法”内–APHA(美国公共卫生协会),USEPA,AOAC,USNCIMS,UKDWI,IBWA,WHO……Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 假阳性比较：vs滤膜法Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 假阳性比较：vs滤膜法*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997报告者：英国泰晤士水务样品来源：泰晤士河，样品数450个Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 假阳性比较vs滤膜法*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997产生的原因传统方法培养基非选择性,会产生相似结果引起假阳性反应培养基污染样品交叉污染操作误差结论试验证明可以用Colilert取代滤膜法进行大肠菌群和大肠埃希氏菌，还证明了Colilert—DST酶底物法是不受化学、外力等外界因素变化而变化的。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 假阴性比较：vs滤膜法及多管法*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997假阴性率产生的原因由于是非特异培养基所以会有杂菌干扰清洁剂、盐、抗生素、毒素、温度等原因会造成抑制反应非发酵大肠菌膜过滤法的问题–过滤膜的损坏m-endoMF*MTF*MLSBMF**Colilert**0%5%10%15%20%25%30%35%40%*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 实验步骤：Colilert对比滤膜法滤膜法72步科立得:5步Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 实验步骤：97孔定量盘法vs多管发酵Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 测试时间比较表Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 经济成本分析传统方法科立得固定设备无菌室、显微镜、抽滤设备等封口机、紫外灯耗材滤膜、平皿、试管、总大肠菌群的培养基、大肠埃希氏菌培养基科立得、定量盘效率和人力2-3人，3-5天1人，1天Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 定性检测操作示范－2步法加入科立得试剂，摇晃至溶解36C培养24小时，判断结果:1,无颜色变化－阴性2,黄色－总大肠菌群阳性3，黄色且荧光－大肠埃希氏菌阳性44.5℃培养24小时,判断结果：1、无颜色变化－阴性2、黄色－粪大肠菌群阳性Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 定量检测（51孔定量盘）－5步法加入科立得试剂后，摇晃至溶解将Colilert溶液倒入51孔（或97孔）定量盘Quanti-Tray®内Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 将定量盘Quanti-Tray®放入程控定量封口机Sealer封口36℃或44.5℃培养24后，计算呈阳性反应的格子，然后对照MPN表计数定量检测（51孔定量盘）－5步法Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 固定底物技术酶底物法科立得－所需试剂及设备定性科立得试剂取样瓶（可用玻璃瓶替代）定量科立得试剂取样瓶（可用玻璃瓶替代）51孔/97孔定量盘程控定量封口机Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. Colilert使用总结检测指标培养温度(℃)定性检测定量检测(100ml)总大肠菌群和大肠埃希氏菌(同时)36±1黄色:总大肠菌群阳性黄色+荧光:大肠埃希氏菌51孔:1-200MPN97孔:1-2419MPN粪(耐热)大肠杆菌44.5黄色:粪(耐热)大肠菌群阳性51孔:1-200MPN97孔:1-2419MPNEvaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 科立得市场占有率美国的市场占有率为95%欧洲的市场占有率为90%全国有20余家环境监测站（如北京、上海、四川、厦门、郑州、沈阳等）、40余家自来水公司、35家省市级疾病预防控制中心及水文站Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 应用案例2004年非典—爱德士捐赠科立得试剂给中国CDC及上海CDC抗拒非典2008年汶川地震—爱德士公司捐赠1000套科立得试剂到四川省CDC及环境监测站2008年奥运会—协助北京自来水及北京CDC完成奥运安全供水任务与中国环境监测站、上海环境监测站及厦门环境监测站做了对比实验Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 案例分析2004年非典—爱德士捐赠科立得试剂给中国疾病预防控制中心及上海中国疾病预防控制中心抗拒非典困难解决时间紧24小时出结果任务重操作简便，无需判断典型菌落，对实验员专业水平要求不高责任大国标方法，结果准确可靠Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 案例分析2008年汶川地震—爱德士公司捐赠1000套科立得试剂到四川省CDC及环境监测站—第一家捐赠试剂到灾区的厂家困难解决条件恶劣无需专用的无菌室专业的操作人员少操作简单，无需专门培训，只需根据颜色变化判读结果，对操作员要求低保障安全供水--最快的检测出符合要求的水源24小时可检测出两个指标，结果准确，符合国标要求。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 案例分析2008年奥运会—协助北京自来水及北京CDC完成奥运安全供水任务困难解决检测频率高，水样多操作简便，手工操作时间短--<1分钟。奥运期间，北京环境监测站全部使用科立得试剂作为日常检测快速发现问题并解决--保障各世界运动员安全饮水24小时可检测出两个指标数据准确，责任重大国标方法，结果准确可靠Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 多管发酵法与科立得在检测粪大肠菌群的比较中国环境监测站、上海环境监测站及厦门环境监测站检测几百组数据的结果此文章发表在《中国环境监测》杂志2008年第4期Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 定性检测配置单序号产品编号产品名称单位报价198-12973-00DST酶底物法24小时科立得试剂,可作200个样品200/盒298-09221-00取样瓶200个/盒,120毫升带100毫升刻度,含硫代硫酸钠,适用含氯水样盒398-14125-EU6瓦特可充电紫外灯,220V,366nm个4培养箱个598-11682-00阳性标准比色瓶瓶Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 准确性通过美国EPA认证通过《生活饮用水卫生标准》认证避免试剂直接加入时散落污染环境及操作员本身，同时也避免由于试剂加入不完全造成结果的不准确。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd. 谢谢！Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.
