急慢性运动对糖尿病大鼠肝脏瘦素-AMPK信号通路的影响

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分类号密级学号20090403020048学位论文急慢性运动对糖尿病大鼠肝脏瘦素-AMPK信号通路的影响研究生姓名：王一涵指导教师：衣雪洁教授申请学位级别：硕士申请学位种类：医学□√全日制学术型硕士学位□全日制应用型硕士学位申请学位类别：□在职专业硕士学位□同等学力专业（领域）运动人体科学专业：方向运动与适应方向论文提交日期：2012年3月论文答辩日期：2012年5月答辩委员会主席：评阅人：沈阳体育学院2012年3月 ADissertationinPhysicalEducationEffectsofaerobicandacuteexerciseonleptin-AMPKintheliveroftype2diabeticratsWANGYi-hanSupervisorbyProfessorYIXue-jieShenyangSportUniversityFebruary2012 独创性声明本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下独立完成的。论文中取得的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：日期：学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解沈阳体育学院有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意沈阳体育学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。作者和导师同意网上交流的时间为作者获得学位后：半年□一年□一年半□两年□学位论文作者签名：导师签名：签字日期：签字日期：I 摘要研究目的：探讨长期有氧运动及一次性运动干预对高脂膳食结合小剂量STZ诱导的老龄雄性糖尿病大鼠肝脏瘦素-AMPK信号通路的影响，旨在阐明不同运动在改善2型糖尿病引起的肝脏瘦素-AMPK信号通路障碍中的作用及其作用机制。研究方法：1、将52只11月龄的雄性SD大鼠随机分为4组，普通对照组、糖尿病对照组、糖尿病慢性运动组、糖尿病急性运动组，各12-14只，除普通对照组用正常饲料喂养外，其余三组均以高脂饲料喂养，共16周。2、各糖尿病模型组经过八周高脂喂养后，腹腔内注射小剂量链脲佐菌素，诱发2型糖尿病，造模后对糖尿病慢性运动组进行为期八周的游泳训练，对糖尿病急性运动组，于16周取材前进行一次性游泳训练。3、各组大鼠于第16周结束时取样，测定血糖、胰岛素、肝脏中肝糖原、TG、FFA含量和AMPK信号通路相关指标蛋白表达及磷酸化水平。研究结果显示：1、糖尿病对照组体重、安静血糖值、血清胰岛素水平均显著高于普通对照组(P﹤0.01，P﹤0.01，P﹤0.01),肝脏中肝糖原、甘油三酯、游离脂肪酸含量均高于普通对照组(P﹤0.01，P﹤0.01，P﹤0.05)，肝脏中瘦素水平显著升高（P<0.05），瘦素受体水平变化不大，AMPKα1蛋白表达、磷酸化表达显著降低（P<0.05，P<0.05），AMPKα2蛋白表达、磷酸化表达显著降低（P<0.05，P﹤0.01），ACC蛋白表达、磷酸化水平无显著改变。2、糖尿病慢性运动组与糖尿病对照组相比，体重变化不大，血清胰岛素、安静血糖值显著降低(P﹤0.01，P﹤0.01)，肝糖原、TG、FFA含量显著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.05），肝脏中瘦素水平显著下降（P<0.05），瘦素受体水平变化不大，AMPKα1蛋白表达无显著改变、磷酸化表达显著增加（P<0.05），AMPKα2蛋白表达、磷酸化表达显著增加（P<0.05，P<0.05），ACC蛋白表达显著下降、磷酸化水平显著上升（P<0.05，P<0.05）。3、糖尿病急性运动组与糖尿病对照组相比大鼠体重变化不大，血清胰岛素水平显著降低（P<0.01），血糖水平无显著差异，肝糖原、TG、FFA含量变化不大，肝脏中瘦素水平显著下降（P<0.05），瘦素受体水平无明显变化。AMPKα1蛋白表达无显著改变，AMPKα1磷酸化表达显著增加（P<0.05）。AMPKα2蛋白表达显著增加（P<0.01）、磷酸化表达显著增加（P<0.05）。ACC蛋白表达显著下降（P<0.05），磷酸化水平无显著改变研究结论：1、2型糖尿病大鼠肝脏瘦素-AMPK信号转导途径受损可能是引发了肝脏糖脂代谢紊乱的机制之一。2、长期有氧运动可通过修复肝脏瘦素-AMPK信号转导途径缓解了肝脏的瘦素抵抗，改善I 糖脂代谢紊乱。3、一次性运动引起肝脏通过瘦素-AMPK信号转导途径调节糖脂代谢的应激性反应可持续16小时。建议：在实验条件允许情况下，可进一步对ACC下游蛋白丙二酸单酰辅酶A脱羧酶（MCD）活性及丙二酸单酰辅酶A（MA）浓度进行测定，同时结合生化指标测试结果，探讨整条信号通路各蛋白蛋白表达及活性变化一致性。关键词：糖尿病;急慢性运动;肝脏;瘦素-AMPK信号通路II AbstractObjective:Todevelopanoldmaleratmodelofdiet-inducedobeseandtypeIIdiabeticbyhighfatdiets，andtostudytheeffectofaerobicexerciseandacuteexerciseonproteinexpressionofleptinsensitivityandsignalinginliver,thisstudytriedtoexplorethemechanismthataerobicandacuteexerciseimprovesthedisorderofleptinsensitivityandsignalinginliver.Methods:1.52malerats11monthsoldwererandomlydividedinto4groups:normalcontrolgroup，diabetescontrolgroup,aerobiccampaigngroup,acutecampaigngroup.12ratseachgroup.Thenormalcontrolgroupratswerefeedednormaldietfor16weeks.Thegroupsexceptnormalcontrolgroupwerefeededhighglucoseandhighfatdietfor16weeks.2.Diabeticratmodelwereinducedbyintraperitonealinjectionwithstreptozotocin(STZ)attheendofthetwelvethweek，then，aerobiccampaigngroupwereswimmingtrainedeightthweeks.Acutecampaigngroupwereswimmingtrainedforonetimebeforebekilledinthe24week.3.After16week-interventions,alltheratswerekilledandTG,FFA,hepaticglycogen,leptin,leptinreceptorsAMPKα1,p-AMPKα1,AMPKα2,p-AMPKα2,ACCandp-ACCinliverweredetermined.Results:1.Comparedwithnormalcontrolgroup,diabetescontrolgrouphadsignificantincreasedweight(P<0.01)，bloodsugar(P<0.01)，insulin(P<0.01).Comparedwithnormalcontrolgroup,diabetescontrolgrouphadincreasedTG(P<0.01)，FFA(P<0.05),hepaticglycogen(P<0.01)inliver.Comparedwithnormalcontrolgroup,diabetescontrolgrouphadincreasedleptin(P<0.05),depressedAMPKα1(P<0.05),p-AMPKα1(P<0.05),AMPKα2(P<0.05),p-AMPKα2(P<0.01).Leptinreceptor,ACC,P-ACChadnotsignificantchangedinliver.2.Comparedwithdiabetescontrolgroup，aerobiccampaigngrouphadsignificantdecreasedfastingbloodglucose（P<0.01)andinsulin(P<0.01).TG(P<0.01)，FFA(P<0.05),hepaticglycogen(P<0.05)haddecreasedsignificantly.Leptin（P<0.05）,ACC（P<0.05）inliverdecreasedsignificantly.Comparedwithdiabetescontrolgroup，aerobiccampaigngrouphadIII significantincreasedp-AMPKα1(P<0.05),AMPKα2(P<0.05),p-AMPKα2(P<0.05),p-ACC(P<0.05).3.Comparedwithdiabetescontrolgroup，acutecampaigngrouphadsignificantdecreasedinsulin(P<0.01).TG，FFA,hepaticglycogenhadnotdecreasedsignificantly.Leptin（P<0.05）,ACC（P<0.05）inliverdecreasedsignificantly.Comparedwithdiabetescontrolgroup，acutecampaigngrouphadsignificantincreasedp-AMPKα1(P<0.05),AMPKα2(P<0.01),p-AMPKα2(P<0.05).Bodyweight,fastingbloodglucose,leptinreceptor,AMPKα1,p-ACChadnotchangedalot.Conclusion:1.ImpairedleptinAMPKsignaltransductionpathwayintype2diabeticratliveristriggeredoneofthemechanismsofhepaticglucoseandlipidmetabolismdisorders.2.ChronictrainingcaneaseleptinresistanceandimproveglucoseandlipidmetabolismdisordersthroughtherepairofliverleptinsignaltransductionpathwayofAMPKliverleptinresistance.3.AcuteexerciseinducedstressresponseofregulatingglucoseandlipidmetabolisminliverbyleptinAMPKsignaltransductionpathwayssustained16hours.Suggestion:Inthepermissionoftheexperimentcondition,wecandeterminethedensityofMAtoensurethecoincidenceofleptinsignalinginthefuture.KeyWords:diabetes;chronicandacuteexercises;liver;leptin-AMPKIV 目录摘要.......................................................................IABSTRACT...................................................................III目录........................................................................V1前言.......................................................................11.1选题意义................................................................11.2论文创新点..............................................................21.3研究方法及意义..........................................................22材料及方法.................................................................32.1材料....................................................................32.1.1实验对象.............................................................32.1.2动物饲料配制及注射药物剂量............................................32.1.3主要试剂.............................................................32.1.4主要仪器..............................................................42.2实验方法................................................................42.2.1糖尿病模型的建立......................................................42.2.2分组运动干预.........................................................52.2.3标本的采集...........................................................52.2.4指标的检测...........................................................62.2.5统计学处理...........................................................103实验结果..................................................................113.1各组大鼠体重、血糖、血清胰岛素变化结果.................................113.2各组大鼠肝糖原、甘油三酯、游离脂肪酸变化情况...........................123.3各组大鼠肝脏瘦素、瘦素受体、AMPKα1/2、AMPKα2、ACC蛋白含量的变化情况..133.3.1各组大鼠肝脏瘦素、瘦素受体蛋白含量的变化情况........................133.3.2各组大鼠肝脏AMPKα1、AMPKα2蛋白表达及其磷酸化水平情况.............143.3.3各组大鼠肝脏ACC蛋白表达及其磷酸化水平情况..........................15V 4分析与讨论................................................................174.1急、慢性运动对2型糖尿病大鼠体重、血糖、胰岛素水平的影响...............174.1.12型糖尿病大鼠体重、血糖、胰岛素水平特征.............................174.1.2急、慢性运动对2型糖尿病大鼠体重、血糖、胰岛素水平的影响.............174.2急、慢性运动对2型糖尿病大鼠肝脏中肝糖原、游离脂肪酸和甘油三酯水平的影响184.2.12型糖尿病大鼠肝脏中肝糖原、游离脂肪酸和甘油三酯水平特征.............184.2.2急、慢性对2型糖尿病大鼠肝脏中肝糖原、游离脂肪酸和甘油三酯水平的影响194.3急慢性运动对2型糖尿病大鼠瘦素-AMPK信号通路各蛋白的影响................204.3.12型糖尿病对大鼠瘦素-AMPK信号通路各蛋白的影响.......................204.3.2不同训练对2型糖尿病大鼠瘦素-AMPK信号通路各蛋白的影响...............225结论与建议................................................................255.1结论...................................................................255.2建议...................................................................25参考文献....................................................................26致谢......................................................................30作者简介....................................................................31攻读学位期间的学术活动情况..................................................32VI 1前言1.1选题意义近年来，全球肥胖、2型糖尿病患病率不断上升。肥胖及2型糖尿病给机体带来一系列不良影响，可引发血糖升高和脂代谢异常，严重威胁人类健康，成为继心血管和肿瘤之后的第三大非传染性疾病，给社会和经济带来沉重的负担。瘦素是脂肪组织中合成的一种分泌型蛋白质激素，分子量为16KD。瘦素通过与靶细胞膜上的瘦素受体（OB-R）结合发挥其生物学功能，具有降低食欲、提高能量代谢效率、减少脂肪储备及减轻体重的功能。瘦素受到多种因素的调节，机体的脂肪百分比是影响瘦素水平的重要因素之一，另外瘦素水平还与性别、胰岛素水平以及生物节律性有关。瘦素抵抗会引发瘦素受体后信号转导通路障碍。目前分子生物学对瘦素受体后JAK/STAT信号转导通路、MAPK/ERK途径、PI3K/PDE3B/cAMP通路研究较多，肯定了瘦素与瘦素抵抗与肥胖发生的关系。有关瘦素受体后AMPK-ACC途径的报道也逐渐出现，瘦素可通过此途径调节糖脂代谢、缓解肥胖症及糖尿病的发生发展。运动对胰岛素抵抗状态下瘦素-AMPK-ACC信号转导通路影响的研究比较少，特别是对不同运动方式对此通路的影响观点不一致。糖尿病病因及发病机制十分复杂，目前尚未完全阐明。长期高脂、高糖膳食以及缺乏运动锻炼引发的肥胖症是导致2型糖尿病的高危因素，因此，控制肥胖症的发生是降低2型糖尿病患病率的一个重要途径。近年来研究证明，几乎所有肥胖症患者都伴随胰岛素抵抗。肥胖、二型糖尿病患者中，瘦素水平上升直接引起瘦素受体水平反馈性下调并引发瘦素受体后信号转到通路障碍，导致瘦素抵抗。胰岛素抵抗和瘦素抵抗是肥胖、二型糖尿病的重要特征。研究发现，生理水平下瘦素通过与其受体结合可以活化细胞中的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）,使乙酰辅酶A羧化酶(ACC)失活,脂肪酸合成减少;同时活化丙二酸单酰辅酶A脱羧酶(MCD),导致丙二酸单酰辅酶A（MA）浓度下降，以改善血糖及血脂水平。肥胖患者易发生瘦素抵抗，表现为体内游离瘦素水平高，敏感性下降，与瘦素受体结合率下降。有资料表明，瘦素抵抗容易引发胰岛素抵抗，[1],同时，瘦素可通过AMPK-ACC途径调节糖脂代进而加剧2型糖尿病的发生发展谢、缓解肥胖症及糖尿病的发生发展，瘦素和胰岛素抵抗会对瘦素-AMPK-ACC信1 号通路各蛋白正常级联反应产生影响。瘦素和胰岛素抵抗状态下，AMPK活性降低，ACC去磷酸化，活性增加，脂肪酸合成增加，脂肪酸氧化水平下降，进一步加剧脂肪堆积。1.2论文创新点目前对于运动对瘦素受体后AMPK信号转导通路的研究较少，对该通路的研究多停留在运动对某一蛋白的影响，忽略了对于各蛋白之间级联反应的研究。另外，运动对瘦素受体后AMPK信号转导通路的影响于中枢和外周组织表现出趋势不一致，同时，运动对该通路的影响受运动模型的影响，表现出变化趋势的不一致现象。本研究采用了长期递增负荷运动和一次性运动两种运动方式对运动引起瘦素受体后AMPK信号转导通路的影响进行深入研究，以探索不同形式的运动对于改善2型糖尿病的作用以及作用机制。1.3研究方法及意义肝脏是代谢的中枢性器官，在糖脂代谢的调节中起至关重要的作用，可反映全身糖脂代谢情况。肝脏的调节作用主要表现在糖异生、糖元合成、贮藏和作为能源的葡萄糖的摄取、利用及释放。瘦素和胰岛素抵抗状态下，肝脏糖脂代谢发生异常，糖异生水平降低，糖元合成增加，脂肪堆积增加。[2]运动训练可以提高瘦素的敏感性，改善瘦素抵抗以及食源性肥胖。目前普遍观点是，长期运动及急性运动都可以不同程度提高血清瘦素的敏感性，缓解瘦素抵抗，但作用靶点不甚明确。本实验试图通过高脂膳食结合小剂量STZ诱导的2型糖尿病动物模型，并施以一次或长期的一定强度的运动干预，探讨急慢性运动对于瘦素受体后AMPK信号转导的影响机制，为治疗肥胖及2型糖尿病提供理论依据。2 2材料及方法2.1材料2.1.1实验对象15个月龄的雄性SD大鼠52只，由中国人民解放军军事医学动物实验中心提供。2.1.2动物饲料配制及注射药物剂量基础饲料：每100g基础饲料中含：20g大麦粉、10g去除水分的包心菜、20g豆粉、1g酵母、5g骨粉、16g玉米粉、16g麸皮、10g鱼粉、2g食盐。基础饲料总能量11.7kJ/g(碳水化物53.21%、脂肪19.8%、蛋白质26.99%)。高脂饲料：每100g高脂饲料中含有下列营养物质：鸡蛋10g、猪油20g、糖9.5g、盐1.5g，其余部分为基础饲料。高脂饲料总能量12.57kJ/g(碳水化合物32.99%、脂肪41.48%、蛋白质25.53%)。动物饲料由沈阳前民饲料厂提供。注射药物为链脲佐菌素，注射剂量为35mg/kg大鼠。饲养条件：普通对照组以普通饲料喂养，其余三组均采用高脂饲料分笼喂养，饲养过程共持续16周，每笼大鼠不超过5只，各组大鼠自由摄取饮食饮水。饲养环境：动物房温度（22±5）℃，相对湿度（50±10）％，明暗周期12∕12，鼠笼每日消毒。将大鼠按体重随机分组，分组情况以及运动方案见表1。饲养人员需每天记录大鼠的摄食摄水量，每周定时称体重，观察大鼠健康状况。2.1.3主要试剂试剂名称生产厂家游离脂肪酸测定试剂盒南京建成生物工程研究所肝糖原测定试剂盒南京建成生物工程研究所甘油三酯测定试剂盒南京建成生物工程研究所链脲佐菌素Sigma公司125I-胰岛素放射免疫分析药盒北京中国原子能科学研究院同位素研究所AMPKα1抗体SANTACRUZBiotechnology公司P-AMPKα1抗体SANTACRUZBiotechnology公司AMPKα2抗体SANTACRUZBiotechnology公司3 P-AMPKα2抗体SANTACRUZBiotechnology公司瘦素抗体北京博奥森生物公司瘦素受体抗体北京博奥森生物公司ACC抗体Cellsignaling生物公司P-ACC抗体Cellsignaling生物公司2.1.4主要仪器仪器名称生产厂家MD-100半自动生化分析仪北京鸿澳医疗公司6010紫外/可见分光光度仪AgilentTechnologiesAE200电子分析天平上海天平仪器厂GC-1200γ-放射免疫计数器中国科学技术大学科学实业总公司DYY-7C电泳和电转移装置北京六一厂Epsonperfection1670扫描仪日本Epson公司2.2实验方法2.2.1糖尿病模型的建立以11个月龄雄性SD大鼠作为研究对象，按大鼠体重将其分为四组，分别为普通对照组（12只），糖尿病对照组（13只），糖尿病慢性运动组（13只），糖尿病急性运动组（14只）。目前最广泛的2型糖尿病造模方法是高脂膳食加小剂量化学药物诱发进行造模。本研究即采用以上造模方法制造2型糖尿病模型。首先，通过8周高脂膳[3]食诱发肥胖，再经注射化学药物（35mg/kg链脲佐菌素）诱发2型糖尿病。在本实验造模过程根据这一方法，有针对性的对大鼠分组喂养、造模。分组时，正常对照组和糖尿病模型组大鼠基础体重、空腹血糖无显著差异，高脂膳食期间，高脂膳食的大鼠体重增加迅速，如表1所示，糖尿病模型组大鼠由于高脂膳食，体重显著超过正常组(平均超重20%)，符合超重或肥胖标准。糖尿病对照组、糖尿病急性运动组各剔除1只肥胖抵抗鼠后，给予高脂膳食组大鼠腹腔注射小剂量（35mg∕kg）的链脲佐菌素，注射后72h尾部取血，连续3次测其空腹血糖，高于16.7mmol∕L的被选用，作为糖尿病大鼠。糖尿病造模成功后开始运动，采用递增运动负荷形式游泳运动8周，每周运动六天，休息一天，每天上午运动，运动方案如表1所示。4 表1大鼠肥胖造模前后体重（n=52）普通对照组高脂组造模前622.38±33.21622.75±28.04高脂喂养8周后647.75±36.26744.68±67.69表2大鼠分组情况及运动方案正常对照组糖尿病对照组糖尿病慢性运动组糖尿病急性运动组全程普通饲料，全程高糖高脂饲料，全程高糖高脂饲料，全程高糖高脂饲料，第无运动干预无运动干预第8周开始运动，持16周取材前进行一次续八周性运动2.2.2分组运动干预糖尿病造模后对糖尿病慢性运动组进行为期八周的递增负荷游泳运动干预，水温32-36℃，动物泳池水深50厘米，每只动物游泳约占有350平方厘米的活动表面积。游泳运动方案见表3、表4。表3每周游泳时间与间隔时间第一周第二周第三周第四周第五周第六周第七周第八周游泳时间min10-3030-4040-5030*240*245*245*245*2间隔时间min0003040454545总游泳时间min10-3040506080909090表4急性运动游泳时间取材前36小时适应性游泳取材前12小时一次性游泳游泳时间min1045*2间隔时间min045总游泳时间min1090大鼠死亡率统计：正常对照组：0%，取材时剩12只；糖尿病对照组：8.33%，取材时剩11只；糖尿病慢性运动组：38.4%，取材时剩8只；糖尿病一次性运动组：15.3%，取材时剩11只。大鼠死亡原因不清，可能与训练劳累，湿冷等有关。取材时为保持各组样本数量一致，随机剔除多余大鼠，每组取8只。2.2.3标本的采集所有组别大鼠取材前禁食12h。糖尿病一次性运动组大鼠于末次运动结束后12-16h取材。糖尿病慢性运动组大鼠于末次运动结束后36-48h取材。取材时，5 腹腔注射20%戊巴比妥钠（7ml/kg体重）麻醉大鼠，麻醉后尾部取血，测空腹血糖。取眼球血制备血清留作测定血清胰岛素。继而腹腔注射胰岛素（3.3ul/kg大鼠体重），分别在注射后即刻，5min，15min，30min，测量尾部血糖水平。腹腔静脉取血用来制备血清（以测定生化指标）。血清制备方法：3500rpm离心10min后，使用移液枪将上层血清吸出，分离血清。取血后迅速分离肝脏，保存于-80℃低温冰箱中，待测肝脏中FFA、TG、肝糖原水平及瘦素、瘦素受体、AMPKα1、AMPKα2、ACC蛋白含量以及P-AMPKα1、P-AMPKα2、P-ACC磷酸化水平。2.2.4指标的检测2.2.4.1空腹血糖测定：采用葡萄糖氧化酶法（血糖仪产自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。）2.2.4.2肝脏中游离脂肪酸测定：游离脂肪酸采用铜显色法测定（采用由南京建成生产的游离脂肪酸测定试剂盒）(l)原理匀浆液中游离脂肪酸能与铜离子结合可形成脂肪酸的铜盐，溶于氯仿中，氯仿中铜盐含量与匀浆液中游离脂肪酸含量成正比。用铜试剂测定匀浆液中铜离子的含量，从而推算出游离脂肪酸的含量。(2)测定方法操作步骤：取肝脏0.1g加入1.8ml生理盐水中，匀浆后3000r/min离心15min，取上清。表5采用比色法测定步骤见下表空白管标准管测定管双蒸水（ml）0.20.2—1000μmol/L棕搁酸(ml)—0.2—样本（ml）——0.2试剂二缓冲液（ml）0.50.50.5试剂三铜试剂（ml）1.01.01.0试剂一（ml）4.03.84.0采用抽提方式，充分混匀2分钟，3500rp/m,离心10分钟，用穿刺针仔细吸去上层蓝色液体以及蛋白质凝块，弃之，吸取下层液体2ml进行显色。下层抽提液（ml）2.02.02.0显色剂（ml）0.250.250.256 混匀，室温放置2分钟，440nm波长，1cm光径下，用试剂一调零，将样品一一比色。（3）计算公式测定管吸光度一空白管吸光度游离脂肪酸含量(μmol/ml)=X标准管浓度标准管吸光度一空白管吸光度（1000umol/l）2.2.4.3肝脏中甘油三酯测定：试剂盒产自南京建成生物研究所用半自动生化分析仪测定。操作步骤：取肝脏0.1g加入1.8ml生理盐水中，剪碎、匀浆，匀浆液3000r/min离心15min，取上清备用。表6采用比色法测定(试剂盒为南京建成生物研究所产)步骤见下表空白管标准管测定管样本（ml）——0.01校准品(ml)—0.01—双蒸水（ml）0.01——工作液（ml）1.001.001.00分别混匀，37℃保温10分钟，上机测定2.2.4.4肝脏中肝糖原测定：采用蒽酮法测定(1)所需试剂5%三氯乙酸：25g三氯乙酸溶于500ml蒸馏水。2g/L蒽酮配制：0.2g蒽酮缓慢倒入100ml浓硫酸。0.1g/L葡萄糖标准液：100mg葡萄糖溶于1000ml蒸馏水中(2)操作步骤：取肝脏组织50mg，剪碎后用5%三氯乙酸定容为5ml，3000r/min离心5min，取上清。表7采用蒽酮法测定（步骤见下表）123456样品葡萄糖标准液（ml）00.20.40.60.81.0—待测肌糖原液(ml)——————0.5蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.200.5蒽酮试剂（ml）4.04.04.04.04.04.04.0混匀，沸水浴10分钟，冷却至室温，在620nm波长比色，记录各管OD值，7 绘制标准曲线。（3）结果计算光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。通过标准曲线查出组织匀浆液糖原浓度，按下面共识计算组织糖原百分含量。肝糖原含量（mg/g）=（肝糖原液浓度*稀释倍数*匀浆液总体积/组织总量）*100%2.2.4.3血清胰岛素测定：放射免疫法。(1)实验原理：采用放射免疫分析方法测定大鼠血清胰岛素的含量，待测样品、标准品中的胰岛素和125I-胰岛素与有限量的抗体竞争结合，125I-胰岛素一部分与抗体结合为复合物，另一部分游离。加入分离试剂离心，使复合物与游离物分离，弃去上清液，测定沉淀物的放射性计数，待测样品和标准品中的胰岛素含量与复合物的放射性强度呈负相关，使用一系列、不同浓度的胰岛素做标准品，可获得标准曲线，从标准曲线上可查出样品中胰岛素含量。(2)操作步骤：保证待测试剂充分溶解，平衡至室温后，即按下表顺序加样及操作。表8胰岛素放免分析操作程序表T管非特异管（NSB）零标准管标准管待测管温育液200100INS标准100待测血样100125I-INS100100100100100INS抗体100100100充分摇匀，37℃温育2小时分离试剂500500500500充分摇匀室温放置15分钟，3500转/分离心20分钟，弃上清液，测各管放射性计数60秒(3)结果计算：由自动γ计数器编制程序，预先给出有关参数、标准曲线以及样品浓度。2.2.4.5瘦素、瘦素受体、AMPKα1、AMPKα2、P-AMPKα1、P-AMPKα2、ACC、P-ACC测定：使用WesternBlot蛋白印迹分析法。试剂配置：(1)电泳电极液:Tris3.02g，甘氨酸14.44g，SDS1g(pH8.0)，加蒸馏水，定容8 至1000ml。(2)转印电极液:Tris3.02g，甘氨酸14.4g，溶于800ml水中，加甲醇200ml,定容至1000ml。(3)分离胶缓冲液(PH8.8):称18.17gTris，加蒸馏水80ml，用浓HCl调PH为8.8，再用蒸馏水定容至100ml。(4)浓缩胶缓冲液(PH6.8):称18.17gTris，加蒸馏水80ml，浓HCl调PH至6.8，再用蒸馏水定容至100ml。(5)ACR:称30g30%丙烯酰胺(Acr)，0.8g0.8%甲叉双丙烯酰胺(BisAcr)，加少许蒸馏水热溶，溶解后，再用蒸馏水定容至100ml。(6)10%SDS:10gSDS溶于100ml蒸馏水中。(7)10*TBS:80gNacl，24.2gTris，定容到1000ml,浓HCl调PH至7.5。(8)TTBS:50ml10*TBS，加蒸馏水定容至500ml,加入0.5mlTween-20。(9)封闭液:1gBSA溶于20mlTTBS中，可用3-5次，冷藏保存。(10)抗体缓冲液:0.1gBSA溶于10mlTTBS中，冷藏保存。(11)裂解缓冲液：20mmol/LTris-HCL，PH7.5，0.1mmol/LNa3VO4，25mmol/LNaF，25mmol/Lβ-glycerophosphate，2mmol/LEDTA，2mmol/LEGTA，1mmol/LDTT，1mmol/LPMSF，2μg/mlleupeptin。实验步骤：(1)提取蛋白：取出-80℃低温冰箱中冻存的标本，迅速剪下200mg左右，放入EP管内备用，加入冰预冷的细胞裂解液800μl，将组织块剪碎、匀浆、超声粉碎。4℃，12000rp/m离心20分钟，取上清备用。以上步骤均为冰盒操作。(2)蛋白浓度的测定：采用考马斯亮蓝法测蛋白浓度。已知标准曲线，样品管加入考马斯亮蓝3ml后，室温静置10分钟，于595nm处、1cm光径下，空白管调零后，测各样品管OD值。各标本蛋白含量(mg/ml)=OD标本/OD标准品×标准浓度根据检测结果，用PBS调整各标本浓度，使其统一至相同水平。(3)蛋白变性：取样本上清液100μl，加入20μl(6×)loadingbuffer，沸水浴5分钟，放入-20℃环境下迅速冷却。(4)配胶：①10%分离胶10ml:Acr3.4ml，分离胶缓冲液2.5ml，蒸馏水4ml，APS100μl，SDS100μl，TEMED7.5μl。混匀后灌注分离胶，灌注完毕后，加注少量去离子9 水液封，室温下使胶充分聚合后（约35min），倾去去离子水，用滤纸吸干水迹。②5%浓缩胶10ml:Acr1.7ml，浓缩胶缓冲液1.25ml，蒸馏水6.8ml，APS100μl，SDS100μl，TEMED10μl。充分混匀后灌注浓缩胶，立即插入梳子，浓缩胶充分聚合后（约25min），加入电泳电极液并拔出梳子。分离胶、浓缩胶凝胶时间与温度密切相关。(5)上样：各标本上样150μg蛋白。上样要求精确，保证各泳道上样量一致(6)电泳:分离胶80V，30min;浓缩胶120V，约90min,以Marker完全分开，溴酚蓝不跑出胶板为宜。(7)转印：PVDF膜放入甲醇中激活，约10分钟。切胶后，秉承胶放置于负极，膜放置于正极的原则，70V的电压下，转印两小时。(8)染色：转印后将膜取出，使用立春红染色，摇床染色约5分钟后用TBST洗膜，判断蛋白是否已经转到膜上。(9)封闭：将膜洗至没有红色，用含5％BSA的TBST室温封闭2小时，或4℃过夜。(10)孵育一抗：从封闭液中将膜取出，用TBST洗膜5min×3次，加入一抗抗体稀释液（不同抗体稀释浓度不同），4℃过夜。(11)孵育二抗:从冰箱中取出膜，摇床摇晃约20分钟，将膜从一抗稀释液中分离出来，使用TBST洗15分钟×3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1：10000），室温下，摇床孵育2小时。(12)清洗：TBST洗15分钟×4次。(13)发光显色：发光法显色。将膜取出放置于透光塑料板上，将周围TBST吸干。将发光液1:1混合，混匀后，均匀滴在膜上，迅速放于机器内开始发光。一般采用15秒、45秒、1分钟发光时长。(14)WesternBlot结果量化分析：采用ScionCorporation凝胶成像分析软件进行条带灰度值分析，记录每条带的灰度值。2.2.5统计学处理用SPSS17.0统计软件包进行数据处理分析，所有数据用均数±标准差形式表示，多组比较采用单因素方差分析。10 3实验结果3.1各组大鼠体重、血糖、血清胰岛素变化结果表9取材时各组血清胰岛素、血糖情况(n=32)取材时体重(g)胰岛素μu/mol）空腹血糖(mmol/l)普通对照组618.31±8.1918.58±5.806.08±0.96※※※※※※糖尿病对照组787.37±52.3528.46±4.1917.20±1.42※※＃＃＃＃糖尿病慢性运动组765.78±21.3821.38±6.5514.16±1.65※※＃＃糖尿病急性运动组780.08±48.4919.68±6.1915.20±1.90注:与正常对照组相比：※※：P﹤0.01，※：P﹤0.05；与糖尿病对照组相比：＃＃：P﹤0.01，＃：P﹤0.05。如表9所示，取材时，糖尿病对照组、糖尿病慢性运动组、糖尿病急性运动组大鼠体重均显著高于普通对照组（P﹤0.01）；糖尿病慢性运动组、糖尿病急性运动组与糖尿病对照组相比体重变化不大（P>0.05）。糖尿病对照组胰岛素、安静血糖均显著高于普通对照组（P<0.01），糖尿病慢性运动组、糖尿病急性运动组血清胰岛素显著低于糖尿病对照组（P<0.05，P<0.01）；糖尿病慢性运动组、糖尿病急性运动组血糖均比糖尿病对照组明显下降（P<0.01，P<0.05）。表10注射胰岛素即刻、5min、15min、30min后大鼠血糖变化情况组别即刻5min15min30min(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)普通对照组6.08±0.965.71±0.885.20±0.474.43±0.85糖尿病对照组17.20±1.4217.1±3.5216.20±3.015.28±3.11糖尿病慢性运动组14.16±1.6514.3±4.5513.42±5.2210.77±3.66糖尿病急性运动15.20±3.9715.6±4.4514.71±3.8613.36±4.0511 表11注射胰岛素即刻、5min、15min、30min后大鼠血糖变化率组别即刻5min15min30min普通对照组——-6.08%-14.4%-27.1%糖尿病对照组——-0.5%-5.8%-11.2%糖尿病慢性运动组——+0.1%-5.1%-23.9%糖尿病急性运动组——+2.6%-3.2%-12.1%普通对照组糖尿病对照组糖尿病长期运动组糖尿病一次性运动5.00%0.00%5min15min30min-5.00%-10.00%-15.00%-20.00%-25.00%-30.00%图1各组大鼠胰岛素敏感性变化趋势表10表现各组大鼠注射胰岛素后30分钟内血糖变化情况，表11、图1表现了各组大鼠注射胰岛素后30分钟内血糖变化率，反映出各组大鼠胰岛素耐受性的差异。如图，普通对照组胰岛素敏感性最强，在注射胰岛素即刻、5min、10min、15min内普通对照组血糖递减，降低幅度在四组之中最大。糖尿病对照组胰岛素敏感性最弱，在外源性胰岛素作用下，血糖变化不明显。3.2各组大鼠肝糖原、甘油三酯、游离脂肪酸变化情况表12各组大鼠肝糖原、甘油三酯、游离脂肪酸变化情况(n=32)肝糖原(mg/g)甘油三酯(μmol/g)游离脂肪酸(μmol/g)普通对照组19.86±7.0635.29±20.10103.40±35.80※※※※糖尿病对照组75.14±31.75144.14±50.43179.42±36.25＃＃※※※＃＃＃糖尿病慢性运动组50.86±23.1451.00±15.30116.95±27.57※※※※※糖尿病急性运动组63.14±13.48138.43±33.41163.98±43.99注:与正常对照组相比：※※：P﹤0.01，※：P﹤0.05；与糖尿病对照组相比：＃＃：P﹤0.01，＃：P﹤0.05。12 250※200※※150＃※※※※100※※＃＃※※※＃＃500普通对照组糖尿病对照组糖尿病长期运动组糖尿病一次性运动-50肝糖原(mg/g)TG(μmol/g)FFA(μmol/g)注:与正常对照组相比：※※：P﹤0.01，※：P﹤0.05；与糖尿病对照组相比：＃＃：P﹤0.01，＃：P﹤0.05。图2：各组大鼠肝脏生化指标测试结果肝脏中肝糖原含量糖尿病对照组、糖尿病慢性运动组、糖尿病急性运动组明显高于普通对照组（P<0.01），糖尿病慢性运动组明显低于糖尿病对照组（P<0.05），糖尿病急性运动组明显高于普通对照组（P<0.01），糖尿病急性运动组与糖尿病对照组相比差异不显著。肝脏中甘油三酯含量糖尿病对照组、糖尿病慢性运动组、糖尿病急性运动组明显高于普通对照组（P<0.01,P<0.05,P<0.01），糖尿病慢性运动组明显低于糖尿病对照组（P<0.01），糖尿病急性运动组明显高于普通对照组（P<0.01），与糖尿病对照组相比差异不显著。肝脏中FFA含量糖尿病对照组、糖尿病急性运动组均明显高于普通对照组（P<0.05），糖尿病慢性运动组明显低于糖尿病对照组（P<0.05）。3.3各组大鼠肝脏瘦素、瘦素受体、AMPKα1/2、AMPKα2、ACC蛋白含量的变化情况3.3.1各组大鼠肝脏瘦素、瘦素受体蛋白含量的变化情况表13各组大鼠肝脏瘦素、瘦素受体蛋白表达(n=32)组别瘦素含量瘦素受体含量普通对照组158.03±12.47152.58±16.50※糖尿病对照组190.55±23.48172.57±13.97＃糖尿病慢性运动组155.05±22.97157.51±22.65＃＃糖尿病急性运动组137.34±42.03175.43±24.33注:与正常对照组相比：※※：P﹤0.01※：P﹤0.05；与糖尿病对照组相比：＃＃：P﹤0.01，13 ＃：P﹤0.05。图3各组大鼠肝脏瘦素蛋白表达含量图谱图4各组大鼠肝脏瘦素受体蛋白表达含量图谱表13图3显示，肝脏中，糖尿病对照组瘦素水平明显高于普通对照组（P<0.05），糖尿病慢性运动组与糖尿病对照组相比，瘦素水平显著下降（P<0.05）、糖尿病急性运动组与糖尿病对照组相比，瘦素水平显著下降（P<0.05）。表12图4显示，肝脏中，糖尿病对照组与普通对照组相比，瘦素受体含量变化不显著（P>0.05），糖尿病慢性运动组、糖尿病急性运动组与糖尿病对照组相比，瘦素受体含量变化不显著（P>0.05）。3.3.2各组大鼠肝脏AMPKα1、AMPKα2蛋白表达及其磷酸化水平情况表14各组大鼠肝脏AMPKα1蛋白表达、磷酸化表达(n=32)组别AMPKα1含量P-AMPKα1普通对照组173.57±19.28127.33±9.17※※糖尿病对照组143.17±11.19104.75±5.62＃糖尿病慢性运动组149.53±11.74127.13±3.25＃糖尿病急性运动组143.16±24.80129.83±23.91注:与正常对照组相比：※※：P﹤0.01※：P﹤0.05；与糖尿病对照组相比：＃＃：P﹤0.01，＃：P﹤0.05。AMPKα1蛋白表达：AMPKα1磷酸化表达：图5：各组大鼠肝脏AMPKα1蛋白表达、磷酸化表达含量图谱表14图5显示：糖尿病对照组与普通对照组相比，AMPKα1蛋白表达、磷酸化表达均显著降低（P<0.05），糖尿病慢性运动组、糖尿病急性运动组与糖尿病对照组相比，AMPKα1蛋白表达无显著改变，AMPKα1磷酸化表达均显著增加（P<0.05）。14 表15各组大鼠肝脏AMPKα2蛋白表达、磷酸化表达(n=32)组别AMPKα2含量P-AMPKα2普通对照组145.55±7.12185.72±9.74※※※糖尿病对照组114.07±12.76153.05±10.59＃＃糖尿病慢性运动组139.09±14.47177.19±11.12＃＃＃糖尿病急性运动组157.09±21.41175.06±11.89注:与正常对照组相比：※※：P﹤0.01※：P﹤0.05；与糖尿病对照组相比：＃＃：P﹤0.01，＃：P﹤0.05。AMPKα2蛋白表达：AMPKα2磷酸化表达：图6：各组大鼠肝脏AMPKα2蛋白表达、磷酸化表达含量图谱表15图6显示：糖尿病对照组与普通对照组相比，AMPKα2蛋白表达显著降低（P<0.05）、磷酸化表达显著降低（P<0.01），糖尿病慢性运动组与糖尿病对照组相比，AMPKα2蛋白表达显著增加、磷酸化表达显著增加（P<0.05），糖尿病急性运动组与糖尿病对照组相比，AMPKα2蛋白表达显著增加（P<0.01）、磷酸化表达显著增加（P<0.05）。3.3.3各组大鼠肝脏ACC蛋白表达及其磷酸化水平情况表16各组大鼠肝脏ACC蛋白表达、磷酸化表达(n=32)组别ACC含量P-ACC普通对照组168.37±19.54140.64±36.65糖尿病对照组165.39±17.05145.81±39.25＃※＃※糖尿病慢性运动组133.30±25.16158.98±36.40＃※糖尿病急性运动组132.76±22.52150.15±56.05注:与正常对照组相比：※※：P﹤0.01※：P﹤0.05；与糖尿病对照组相比：＃＃：P﹤0.01，＃：P﹤0.05ACC蛋白表达ACC磷酸化表达图7：各组大鼠肝脏ACC蛋白表达、磷酸化表达含量图谱表16图7显示：糖尿病对照组与普通对照组相比，ACC蛋白表达无显著变化，糖尿病慢性运动组、糖尿病急性运动组与普通对照组、糖尿病对照组相比，蛋白表达均显著下降（P<0.05）。糖尿病对照组与普通对照组相比，ACC磷酸化15 水平无显著变化，糖尿病慢性运动组与糖尿病对照组、普通对照相比，ACC磷酸化水均平显著上升（P<0.05），糖尿病急性运动组与糖尿病对照组、普通对照组相比，ACC磷酸化水平无显著改变（P>0.05）。16 4分析与讨论4.1急、慢性运动对2型糖尿病大鼠体重、血糖、胰岛素水平的影响4.1.12型糖尿病大鼠体重、血糖、胰岛素水平特征按临床表现和发病机制区分，糖尿病可被分为I型糖尿病和2型糖尿病。I型糖尿病是免疫系统疾病，是由于身体的免疫系统攻击胰腺中的胰岛细胞，并最终破坏胰岛细胞制造胰岛素的能力而产生的，表现为高血糖，低胰岛素的症状。2型糖尿病又叫非胰岛素依赖型糖尿病，2型糖尿病患者体内胰岛素水平过高但不敏感，称之为胰岛素分泌相对不足，表现为高血糖、高胰岛素症状。胰岛素是机体中唯一一种有降血糖功能的激素，肥胖和糖尿病患者体内容易存在一种胰岛素相对不足的现象，即胰岛素敏感度降低、胰岛素与胰岛素受体结合率下降。这种胰岛素相对不足的现象称为胰岛素抵抗。老年为2型糖尿病高发的年龄段，有研究证明，随年龄增长，2型糖尿病发病率增加。本实验采用15个月龄雄性SD大鼠作为研究对象，高脂膳食8周后发现，糖尿病模型组与普通对照组相比，体重、血糖、胰岛素水平显著升高，（P﹤0.01,P﹤0.01,P﹤0.05）。说明长期高脂膳食易结合小剂量的STZ诱导大鼠出现代谢紊乱。高血糖水平刺激机体分泌胰岛素来降低血糖，长期高血糖水平会引起胰岛素敏感性下降，即胰岛素降血糖作用不明显，久而久之则产生了高血糖、高胰岛素的症状。高血糖、高胰岛素结合糖尿病大鼠多饮多尿多食体重少的症状，可验证本实验糖尿病造模成功。4.1.2急、慢性运动对2型糖尿病大鼠体重、血糖、胰岛素水平的影响一些研究表明：不同强度、不同时间的运动训练会对2型糖尿病大鼠的体重、[4]血糖、胰岛素水平产生不同的影响。其中刘政潭研究发现，12周有氧运动干预[5]可有效降低2型糖尿病大鼠空腹血糖及运动后非空腹血糖。张月华等人研究发现，持续6周的50%VO2max、每次训练60min、隔日上午训练的跑台运动，可以[6]显著降低2型糖尿病大鼠空腹胰岛素水平。鹿相花等人研究发现，12周中等强度有氧运动能显著降低肥胖2型糖尿病患者血糖、血脂、BMI，缓解胰岛素抵抗。[7]李秋玲研究发现，12周耐力运动可明显降低糖尿病大鼠空腹血糖、提高空腹血清胰岛素水平，增加胰岛素敏感性、降低胰岛素抵抗。本实验采取8周递增负荷17 有氧游泳运动的运动方式也得出了相似的结果，8周递增负荷有氧游泳运动可有效降低2型糖尿病大鼠血糖（P<0.05）、胰岛素（P<0.01）水平，改善胰岛素抵抗，对2型糖尿病有良好的治疗作用，但对降低糖尿病大鼠体重作用不明显（P>0.05）。[8]等研急性运动也可以改变2型糖尿病大鼠血糖、血清胰岛素水平。李明子究发现，中等强度运动40～45分钟，可有效降低运动后2-3小时内血糖。王正[9]等研究发现，中等强度运动后，2型糖尿病患者血糖、血胰岛素降低明显，勇[10]大强度运动后有少数患者血糖下降，大多数患者血糖有应激性升高。何玉秀等研究发现，大鼠禁食后进行急性游泳60分钟，游泳运动后即刻大鼠血胰岛素水平显著低于对照组，1小时后回升，3小时后基本恢复。本实验采取急性游泳运动45min*2组，组间歇45分钟的运动形式进行运动干预，在末次运动后12-16小时取材。实验结果表明急性游泳运动对运动后12-16小时大鼠体重、血糖影响不大，但可显著降低胰岛素水平（P<0.01）。急性游泳运动12-16小时后糖尿病大鼠血糖无显著变化，说明慢性运动组血糖产生的改变可排除急性运动对其产生的影响，为长期运动负荷引起机体产生了适应性反应。从胰岛素耐受性角度，普通对照组胰岛素敏感性最强，在注射胰岛素即刻、5min、10min、15min内普通对照组血糖递减，降低幅度在四组之中最大。糖尿病对照组胰岛素敏感性最弱，在外源性胰岛素作用下，血糖变化不明显。注射胰岛素即刻，糖尿病急性运动组、糖尿病慢性运动组大鼠会由于外伤、紧张或胰岛素未发挥作用而导致血糖应激性上升或保持不变。5分钟后，受外源性胰岛素影响，各组大鼠血糖水平开始下降。糖尿病对照组、糖尿病急性运动组血糖下降幅度相对于普通对照组较小，胰岛素敏感性下降，糖尿病急性运动组比糖尿病对照组血糖变化快。同时发现，糖尿病慢性运动组胰岛素敏感性减退现象有所改善，血糖变化幅度较糖尿病对照组增加。4.2急、慢性运动对2型糖尿病大鼠肝脏中肝糖原、游离脂肪酸和甘油三酯水平的影响4.2.12型糖尿病大鼠肝脏中肝糖原、游离脂肪酸和甘油三酯水平特征糖代谢与脂代谢密切相关，体内合成脂肪的脂肪酸和甘油是由糖代谢而来。脂肪的合成在肝组织最为旺盛,脂酰CoA合成酶催化脂肪酸合成的第一步反应,18 即乙酰CoA合成丙二酰CoA,后者可进一步生成脂肪酸,并能阻止肉碱脂酰转移酶Ι将长链脂肪酸转移至线粒体内膜,从而可减少长链脂肪酸的氧化并促进脂肪酸[11]。万学东[12]研究发现，生理状态下，瘦素可以促进FFA氧和甘油三酯的生成化，抑制TG合成。在正常健康的肝脏细胞中，脂肪酸的摄取，合成，氧化及酯化维持在动态平衡状态，从而可以使肝脏细胞中脂肪酸，甘油三酯保持较低浓度。近来的研究表明,游离脂肪酸、甘油三酯堆积和肝脏胰岛素抵抗在2型糖尿[13]。刘长锁[14]等研究发现，肥胖、2型糖尿病状病发生、发展过程中占重要地位态下，机体脂肪组织含量显著增加，导致肝脏中瘦素含量明显升高。长期高瘦素[15]等研究发现，瘦素抵抗水平，使机体瘦素敏感性下降，导致瘦素抵抗。王立靖可减弱肝脏中游离脂肪酸的氧化作用，增加肝脏中甘油三酯的合成，因此瘦素抵抗在肝脏组织中引发脂代谢紊乱。2型糖尿病患者发生胰岛素抵抗，胰岛素敏感性下降，胰岛素对降低血糖的作用消退，血糖升高导致肝糖原生成增加，过多的糖原在肝脏堆积，引发肝脏糖代谢紊乱。本实验结果显示，高脂膳食结合小剂量STZ引起的糖尿病大鼠肝脏中肝糖原、游离脂肪酸、甘油三酯水平明显高于普通对照组大鼠，可能与瘦素、胰岛素抵抗状态下，肝脏游离脂肪酸氧化作用减弱、甘油三酯合成增加，血糖升高，肝糖原合成增加有关。4.2.2急、慢性对2型糖尿病大鼠肝脏中肝糖原、游离脂肪酸和甘油三酯水平的影响许多研究发现，长期有氧运动可降低血液中的TG、FFA水平，有利于肥胖患者和糖尿病患者机体血脂代谢的改善。BELevin等研究发现，高脂饮食诱导的肥胖大鼠经过有氧运动后，TG含量显著性下降。陈荣等报道，耐力运动使肥胖大鼠血清TGL显著降低。王敬浩、庄小花等报道，2型糖尿病患者进行有氧运动后，其TG、FFA均有明显下降。在肝脏等外周组织中，运动对FFA、TG等指标也[15]有改善作用，但研究相对较少。王立靖等研究发现，持续10周，每周6天，[17]等研究每天60min的游泳训练，可有效降低肥胖大鼠肝脏甘油三酯水平。李雨发现，为期六周的递增负荷游泳运动，可有效降低糖尿病大鼠骨骼肌游离脂肪酸、[17]甘油三酯水平。李汉东等对45例健康老年人施以每周7天，每天1小时的有氧运动干预研究发现，有氧运动可以促进肝糖原分解代谢。本实验结果显示，为期8周的递增负荷游泳运动可有效降低糖尿病大鼠肝脏19 肝糖原、游离脂肪酸、甘油三酯水平。长期有氧运动降低肝脏中肝糖原、游离脂肪酸、甘油三酯水平其机制可能是其一：长期有氧运动消耗能量，促进骨骼肌、[18]等人指出，脂肪组织产生的具有生物学活性的肝脏中糖原分解。其二：LeeY瘦素具有抗脂肪变性的作用,长期有氧运动可以减少肝脏等组织中的脂肪沉积,减少瘦素分泌，缓解瘦素抵抗。瘦素具有促进脂肪酸氧化的作用，故有氧运动使肝脏中游离脂肪酸、甘油三脂含量下降。急性运动对糖尿病大鼠肝糖原、游离脂肪酸、甘油三酯的影响在16小时后表现不明显，糖尿病急性运动组与糖尿病对照组肝糖原、游离脂肪酸、甘油三酯水平无显著差异。4.3急慢性运动对2型糖尿病大鼠瘦素-AMPK信号通路各蛋白的影响4.3.12型糖尿病对大鼠瘦素-AMPK信号通路各蛋白的影响瘦素是一种分泌型蛋白质，是重要的内分泌调节因子。瘦素与其靶细胞表面的瘦素受体结合后发挥调节脂类代谢和能量平衡的作用。生理状态下，进食可以引起胰岛素分泌增加、脂肪合成增加；同时，脂肪增加刺激瘦素分泌，使瘦素分泌增加，瘦素又可通过抑制食欲、增加能量消耗、促进脂肪分解，维持能量代谢平衡。瘦素抵抗会引发瘦素受体后信号转导通路障碍。目前分子生物学对瘦素受体后JAK/STAT信号转导通路、MAPK/ERK途径、PI3K/PDE3B/cAMP通路研究较多，肯定了瘦素与瘦素抵抗与肥胖发生的关系。有关瘦素受体后AMPK-ACC途径的报道也逐渐出现，瘦素可通过此途径调节糖脂代谢、缓解肥胖症及糖尿病的发生发展。AMPK在能量代谢中起重要作用，通过胰岛素非依赖机制促进葡萄糖的摄取。同时AMPK可以抑制肝脏糖异生以降低血糖水平。研究发现，生理状态下，脂肪组织分泌瘦素，在与其受体结合后，通过活化细胞中的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）,使乙酰辅酶A羧化酶(ACC)失活,脂肪酸合成减少;同时活化丙二酸单酰辅酶A脱羧酶(MCD),导致丙二酸单酰辅酶A（MA）浓度下降。MA是脂肪酸合成的限速酶，控制着脂肪酸的合成；同时可以通过抑制在脂肪酸氧化过程中起关键作用的肉碱-棕榈酰转移酶1（CPT1）来抑制脂肪[19]。MA浓度下降会导致脂肪酸氧化速率增加，进而起到减少脂肪酸的氧化过程储备、减轻体重的作用。肥胖、2型糖尿病人群体内游离瘦素水平升高，瘦素敏感性下降，有瘦素抵20 抗现象发生。有研究发现，血清瘦素及脂肪瘦素mRNA与脂肪含量呈正相关，多数肥胖症患者伴随高瘦素血症的发生，肥胖、2型糖尿病患者瘦素水平约为正常[20]等实验研究发现肥胖可使正常人血瘦素受体数目下调，mRNA表人4倍。Kastin[21]等对瘦素抵抗的肥胖大鼠瘦素受体基因表达研究发现，肥胖大达下降；李琳燕鼠脂肪组织中瘦素受体表达比正常大鼠低61.60%，此结果提示：瘦素受体不足可能引发瘦素抵抗，是引起肥胖大鼠瘦素抵抗的重要原因之一。2型糖尿病大鼠肝脏瘦素水平较普通对照组大鼠增加，瘦素受体水平差异不显著。瘦素抵抗的可能由于瘦素受体数量下降或瘦素与其受体结合率下降导致。本实验糖尿病大鼠瘦素受体水平与普通对照组大鼠相比变化不显著，但瘦素水平显著升高，引起瘦素与瘦素受体结合率下降，导致瘦素抵抗。[22]等肥胖、2型糖尿病会使组织中AMPK磷酸化水平降低，活性降低。程媛对28只6周龄的雄性SD大鼠进行高脂膳食喂养，研究发现，肥胖鼠骨骼肌AMPK[23]等研究发现，高糖环境下AMPKα1、α2mRNA表达水平低下,AMPK活性降低。徐静[24]等人蛋白的表达及活性降低。同时，AMPK也受其上游瘦素水平的影响。郭光对3-4周龄的大鼠进行13周肥胖催肥后发生肥胖抵抗现象，研究得出，肥胖抵[25]也抗现象很可能与其瘦素水平升高从而促进AMPK活性提高有关。JanovskáA提到，瘦素通过磷酸化AMPK和ACC来促进脂肪酸的氧化作用。本实验结果显示，高脂膳食和小剂量STZ诱导的与普通对照组相比，糖尿病对照组AMPKα1、AMPKα2蛋白表达及磷酸化水平明显降低。说明高脂膳食和小剂量STZ诱导的2型糖尿病大鼠出现了肝脏瘦素水平升高并下调了AMPK各亚基蛋白表达及磷酸化表达。[26]，同等条件下，12肥胖可能会使ACC活性和蛋白表达增加，有研究发现周龄肥胖大鼠的肝脏ACC活性较普通大鼠高，且其蛋白表达为普通大鼠的300%。同时，也有研究发现，胰岛素和糖皮质激素都会改变ACC的基因表达。其上游蛋[27]等发现，在大鼠白色脂肪组织中，白瘦素对于ACC的活性有抑制作用。Nogalska随着瘦素浓度的升高，ACCmRNA表达逐渐降低；同时，AMPK也可以调节ACC的活性，使ACC磷酸化，抑制ACC的作用。当细胞能量消耗增加或接受外界刺激时，细胞内AMPK含量增加，促进ACC磷酸化、使ACC活性降低，减少脂肪酸合成、促进脂肪酸氧化量，以适应能量增加的需求。维持高的脂肪酸氧化速率和低的脂[28]等研究发现,肪堆积是人们通过运动而试图达到的生理状态。Abu-ElheigaACC2基因缺失的小鼠体内低含量的丙二酰辅酶A导致了脂肪酸氧化速率的增21 加、脂肪组织和肝脏中脂肪堆积的减少以及肝脏中糖原的减少。虽然ACC2基因缺失的小鼠比正常小鼠摄食要多20%～30%,但却可以维持正常体重水平。对ACC2基因抑制方法的研究很可能使人在正常摄取的情况下达到减肥效果。本实验结果表明，高脂膳食和小剂量STZ诱导的2型糖尿病对ACC蛋白表达及其磷酸化水平影响不大，其机制并不清楚，但可能与其亚基ACC1、ACC2的激活与抑制有关。进食和高胰岛素状态下，ACC1是激活状态，协助机体以脂肪形式储存能量或抑制进食。在空腹状态下，ACC2是抑制的，促进脂肪的水解和氧化。在动物取材期间，动物的状态是高胰岛素且空腹的，可能在动物体内引起了ACC亚基的紊乱，影响了ACC的整体水平。瘦素、AMPK、ACC的变化可以证明2型糖尿病状态下瘦素受体后瘦素-AMPK信号通路级联反应的存在。4.3.2不同训练对2型糖尿病大鼠瘦素-AMPK信号通路各蛋白的影响4.3.2.1急性运动对2型糖尿病大鼠瘦素-AMPK信号通路各蛋白的影响有关运动对血瘦素的研究发现，不同运动强度、运动方式对人体血瘦素影响[29]对60min功率自行车练习者运动后即刻血瘦素水平进行测不甚一直。Racette[30]、Dirlewanger[31]等人的研究也支持这一量，血瘦素水平无显著变化。Perusse[32]研究发现，在消耗6270千焦能量的运动后24h内，血浆瘦素的观点。Essing浓度无明显变化，48h后瘦素水平开始下降；采用同样的受试者和实验设计进行二次实验,受试者消耗3344千焦能量的一次性运动后，血浆瘦素水平在各时间点上均无明显变化。Essing的研究说明单次运动对血清瘦素水平的下调作用与时间及运动所消耗的能量有关。但是也有学者发现，受血液流变性和血液分布改变[33]等在研究过程中发现，分别以的影响，急性运动后瘦素水平提高。Fisher50%VO2max和85%VO2max强度进行41min的功率自行车运动,运动期间发现，血清瘦素水平增加，于8h后血清瘦素浓度恢复至对照水平。本实验于运动后12-16小时进行测试，证实了急性游泳45分钟（间歇45分钟）在16小时内对于降低中龄糖尿病鼠瘦素水平有效。[34]同时，急性运动也对AMPK、ACC的蛋白表达和磷酸化水平产生影响。吴毅172等研究发现，急性运动三小时，会使OLETF、LETO大鼠趾长伸肌中AMPKαThr磷酸化水平显著高于对照组，运动组、对照组AMPKα蛋白表达水平无明显变化。一次性运动可引起ACC磷酸化水平增加，ACC活性降低，从而促进脂肪酸氧化分[35]等研究发现，8名成年男解，起到减脂的作用，但持续效果不佳。LittleJP22 子以65%VO2MAX的强度运动90分钟，运动后即刻骨骼肌ACC磷酸化水平增加近[36]等研究发现，急性跑台运动可降低大鼠脂肪细胞ACC活性，抑制五倍。KohHJ[37]等对四男四女进行60分钟中等强度（63%VO脂肪细胞合成。Lee-Young2max）的急性功率自行车运动干预，观察运动后1-24小时AMPK、ACC的变化情况，研究发现：运动后即刻，AMPKα2活性、AMPKα2磷酸化水平以及ACC2磷酸化水平增强。后续研究发现，这些升高的指标在运动后3-24小时内回到了基础水平。且运动后24小时内，AMPKα2、ACC2蛋白表达未发生改变。本实验研究表明：急性游泳干预后16小时，AMPKα2蛋白表达显著增加，AMPKα1、AMPKα2磷酸化表达显著增加，同时，ACC蛋白表达显著下降（P<0.05）、磷酸化表达无显著改变。急瘦素水平下降AMPKα1不变，P-AMPKα1上升性运AMPKα2显著上升，P-AMPKα2上升动瘦素受体不变FFA无显著差异ACC水平下降TG无显著差异P-ACC无显著差异肝糖原无显著差异4.3.2.2慢性运动对2型糖尿病大鼠瘦素-AMPK信号通路各蛋白的影响长期运动对于瘦素水平的影响不尽一致。多数实验结果证明长期运动起下调瘦素水平的作用，且瘦素水平的下调与身体质量的减少相关,长期运动能够增强[38]研究发现，50-69岁绝经妇女在16周耐力训练运机体对瘦素的敏感性。Ryan动干预后，身体质量无下降组，血清瘦素水平变化无显著性差异，身体质量下降[39]对成年男性肥胖者进行为期16个月的组，血清瘦素水平下降36%。Pasman等耐力训练，在训练开始及训练后第2，4，10，16个月检测血液瘦素水平，结果显示血瘦素水平降低且降低水平与训练时间显著相关。另有研究认为，长期运动[40]等对不同运动时间大鼠的血清瘦素水平进训练对血清瘦素水平影响不大。孙焱行分析，在实验中将雄性SD大鼠随机分为肥胖对照组、45min游泳运动组、90min游泳运动组和150min游泳运动组,进行为期8周的游泳训练后，各运动组大鼠血清瘦素水平与对照组相比均无显著性差异。[41]等将8周高脂膳食造IR模型后的肥胖雄性C57BL/6小鼠随机分为牛燕媚23 运动组和对照组两组，运动组进行6周、75%最大摄氧量强度的跑台训练，得出结论运动能使AMPKmRNA和蛋白表达显著增高。刘霞等研究发现，有氧运动联合膳食干预不仅有效提高了二型糖尿病大鼠骨骼肌AMPK含量，还有效上调了AMPK活性。长期运动可使ACC磷酸化表达水平升高，降低ACC活性，且效果较为明显。[42]等对Zucker大鼠进行研究分析，发现肥胖、胰岛素抵抗大鼠SriwijitkamolA骨骼肌ACC磷酸化水平比消瘦型同种类大鼠下降50％，而7周跑台训练后，ACC磷酸化水平又升高近50%，说明长期运动可以很好地改善肥胖及胰岛素抵抗造成[43]等对4周龄OLETF大鼠进的ACC磷酸化水平下降，抑制脂肪合成。RectorRS行观察，发现16周跑台运动使其ACC活性降低35%磷酸化水平上升30%。并发现[44]，每天进行运动的肥胖大鼠若突然停止运动，可引起其肝脏ACC蛋白表达增加，ACC磷酸化减弱，ACC活性增强，肝脏脂肪合成增加。McCarty认为降低肝脏中ACC的活性可降低其甘油三酯的生成。ACC基因表达或活性变化可以直接影响FFA水平。本实验结果显示，持续8周递增负荷游泳运动能明显降低糖尿病大鼠肝脏瘦素水平，改善瘦素抵抗；使AMPKα1蛋白表达显著增加，AMPKα1、AMPKα2磷酸化水平显著增加；同时使ACC蛋白表达显著降低、磷酸化表达显著增加。其原因可能是8周递增负荷游泳运动降低肥胖大鼠体内的脂肪含量，减少瘦素分泌，抑制了瘦素抵抗，使瘦素作用得以发挥，提高了AMPKα1、AMPKα2的磷酸化水平，抑制ACC的活性，同时说明瘦素可以通过作用于AMPK-ACC来发挥其生物学功能。本实验印证了8周递增负荷游泳运动对于糖尿病的改善作用，并进一步印证了瘦素、AMPK、ACC的上下游关系。慢瘦素水平下降AMPKα1水平不变，P-AMPKα1上升性运AMPKα2上升，P-AMPKα2上升动瘦素受体不变FFA下降ACC水平上升TG下降肝糖原下降P-ACC水平上升24 5结论与建议5.1结论5.1.12型糖尿病大鼠肝脏瘦素-AMPK信号转导途径受损是引发了肝脏糖脂代谢紊乱机制之一。5.1.2慢性运动可通过修复肝脏瘦素-AMPK信号转导途径缓解了肝脏的瘦素抵抗，改善糖脂代谢紊乱。5.1.3急性运动引起肝脏通过瘦素-AMPK信号转导途径调节糖脂代谢的应激性反应可持续16小时。5.2建议在实验条件允许情况下，可进一步对ACC下游蛋白丙二酸单酰辅酶A脱羧酶（MCD）活性及丙二酸单酰辅酶A（MA）浓度进行测定，同时结合生化指标测试结果，探讨整条信号通路各蛋白蛋白表达及活性变化一致性。25 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攻读学位期间的学术活动情况发表论文情况：1.《自由式滑雪空中技巧及单板U型场地项目生物学监控的综述》衣雪洁；常波；马毅；王宝明；赵丽；王博；王一涵；王伟[期刊]沈阳体育学院学报2011年2月2.《自由式滑雪空中技巧及单板U型场地项目生物学监控体系与指标的构建》常波；衣雪洁；王宝明；马毅；王一涵；王伟；王博；赵丽[期刊]沈阳体育学院学报2011年4月3.《运动对胰岛素抵抗状态下瘦素-AMPK-ACC信号转导通路的影响》衣雪洁；王一涵；邹文姝；王伟；杨运华；魏伟；常波[期刊]沈阳体育学院学报2012年2月(2)参加学术论坛情况：2010年9月主讲《对我国部分优秀单板滑雪运动员身体成分的研究与分析》(3)参与完成课题情况：1.国家社科基金课题：《我国城市学龄儿童防治肥胖综合干预模型的构建与实践研究》参与2010年8月5日沈阳炮兵学院减肥训练营肥胖儿童生化指标测试工作2.国家科技支撑计划课题：《冬奥会项目专项训练方法与手段的研究与应用》参与2010年1月5日单板滑雪U形池国家队运动员生物学监控测试工作（测试地点：沈阳白清寨滑雪场）参与2011年1月8日-9日自由式滑雪空中技巧国家队运动员心理和生化指标监测工作（测试地点：吉林北大湖滑雪场）3.国家科技支撑计划项目：《青少年日常体力活动水平测量与能量消耗关键技术的研究与应用》全国调研，2011年5月1日-20日沈阳团结路小学、沈阳嘉华学校学生体力活动测试工作32