《基因工程生物化学》PPT课件

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1、2nm大沟(2.2nm)小沟(1.2nm)3.4nmDNA双螺旋结构要点(Watson和Crick，1953)1.DNA由两条反相平行的脱氧核苷酸链组成，脱氧核糖-磷酸骨架位于双链的外侧，碱基位于内侧，双链的碱基之间以氢键相结合。碱基互补配对形式：AT；GC)2.DNA是右手螺旋结构，螺旋直径为2nm，螺距为3.4nm。碱基平面垂直螺旋轴，相邻碱基平面距离为0.34nm，螺旋一圈包含10对碱基。3.氢键维持DNA双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。亲代DNA复制子代DNADNA双螺旋解开成为单链，用于合成新的互补链.子代DNA双链中一股单链是从亲代完整地

2、接受过来另一股单链按碱基配对原则完全重新合成半保留复制DNA复制的酶及蛋白因子1.底物dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)2.聚合酶DNA聚合酶（DNA依赖的DNA聚合酶)DNA--pol3.模板单链的DNA母链4.引物寡核苷酸引物（RNA)5.其他酶和蛋白质因子拓扑异构酶、单链DNA结合蛋白，连接酶解旋酶、引物酶多种蛋白因子DNA聚合酶（DNApolymerase，DNA-pol）—以DNA为模板，催化3'，5'-磷酸二酯键的形成5'3'AGTCATCAGACCC3'5'TCAGGTGATCTGG5'GTCTGGAGACCC5'DNA连接酶基因工程(G

3、eneticengineering)(Centraldogma)基因(Gene)能编码一条多肽链并具有一定长度的DNA分子。基因组(Genome)一种生物全部染色体的遗传物质的总和，以全长DNA的碱基对(bp)数目表示。细菌基因组大肠杆菌：4x106bp人类基因组：3x109bp克隆(Clone)指用无性繁殖方法产生一组遗传上相同的细胞和生物群体过程。这些细胞或个体均来自无性繁殖单一原形细胞。分子克隆(Molecularcloning)利用DNA重组技术可使一个基因或DNA片段产生出许多相同的拷贝。DNA重组技术(RecombinantDNAtechniqu

4、es)利用限制性内切酶、连接酶等在体外将不同生物体的DNA片段进行重新组合的技术。重新组合在一起DNA片段称作重组DNA分子。基因组DNA克隆载体限制性内切酶消化限制性内切酶消化、电泳分离、纯化DNA连接酶重组载体转化或转导大肠杆菌宿主细胞细胞增殖分子克隆的基本过程重组载体在大肠杆菌宿主细胞中复制以产生许多相同的分子拷贝基因组DNA载体(环状DNA)可被克隆的DNA片段线状DNA载体筛选含目的基因的重组子限制性内切酶限制性内切酶转化或转导大肠杆菌重组DNA分子组织mRNAcDNA部分或全部酶切的DNA加衔接物分子DNA连接酶反转录工具酶载体目的基因基因组DNA文

5、库筛选PCR产物cDNA文库筛选RT-PCR产物化学合成宿主细胞导入重组DNA分子到宿主细胞筛选携带目的基因的宿主细胞分子克隆的所需的条件工具酶1.限制性内切酶和修饰酶(Restrictionendonucleasesandmodifyingenzymes)一类存在于细菌中的核酸内切酶，它们识别双链DNA分子上特异的核苷酸序列，并对DNA分子进行剪切。“限制性”只降解外源DNA而不降解宿主DNA；细菌存在甲基化酶，对限制性内切酶识别序列中腺苷酸和胞苷酸进行甲基化而不被限制性内切酶所剪切。这就构成了细菌的“限制-修饰系统”的分子基础。“内切酶”是指酶切位点在DNA

6、分子内，而不是两端。限制性内切酶(Restrictionendonucleases)限制性内切酶的分类回文结构(palindrome)是双链DNA分子中的反向重复结构，即每条链从5’3’方向读其核苷酸序列都相同。5’GGATCC3’5’GGATCC3’3’CCTAGG5’3’CCTAGG5’5’AGATCT3’3’TCTAGA5’5’CCCGGG3’3’GGGCCC5’命名属名(genus)的第一个字母，用大写表示种名(species)的前两个字母，用小写表示细菌株名(strain)，用大写或小写表示同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序，用罗马字表示。类

7、型II限制性内切酶同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序，用罗马字表示属名(大写)EcoRI种名(小写)细菌株名(大写)Escherichia属coli种R株识别序列(1)具有回文结构BamHI5’GGATCC3’3’CCTAGG5’KpnI5’GGTACC3’3’CCATGG5’(2)具有间断的回文结构HinfI(XmnI)5’GANTC3’3’CTNAG5’(3)具有简并性碱基HincII5’GT(T/C)(A/G)AC3’3’CA(A/G)(T/C)TG5’(4)无回文结构MboII5’GAAGA(N)83’3’CT