大学生物化学课件-基因工程.ppt

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1、基因重组与基因工程1、基因重组：指不同来源的DNA在细胞内重新进行组合，并能进行复制、转录、翻译的过程。2、基因工程：在体外用人工的方法进行基因的重新组合，再把重组基因导入到细胞或细菌内进行复制、转录、翻译的技术。第一节自然界的基因转移和重组‘无目的’-自然界的基因转移和重组自然界不同物种和个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。‘有目的’-基因工程第一节DNA的转移和重组（DNAtransfersnfrecombination)DNA重组包括：同源重组（homologousrecombination)特异位点重组（site-sp

2、ecificrecombination)转座重组（transpositionalrecombination)一、同源重组（基本重组）发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。为最基本的DNA重组方式，在原核、真核生物均发生。二、位点特异性重组（site-specificrecombination）由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称～。此过程往往发生在一个特定的短的（20～200bp)DNA序列内（重组位点），并且有特异的酶和辅助因子对其识别和作用。三、转座重组有些基因可以从一个位置移动到另

3、一位置.可移动DNA序列包括：插入序列、转座子由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座。（一）插入序列(insertionsequences，IS)转座典型插入序列：750-1500bpDNA片段包括：两个分离的反向重复（IR)序列;IR侧翼有短的正向重复序列;及一个转座酶编码基因.保守性转座：插入序列从原位迁至新位.复制性转座：插入序列复制后，其中一个复制本迁至新位，另一个保留在原位.（二）转座子(transposons)转座可从一个染色体位点转移至另一位点的分散的重复序列，即一段可以发生转座的DNA。组成：侧翼为两个分离的反向重复序列；转座酶基因；抗生素抗

4、性等有用的基因。第二节重组DNA技术基因工程（geneticengineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表达"），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。克隆（clone）：来自同一始祖的相同副本或拷贝（copy）的集合。完整DNA克隆过程包括：①目的基因获取；②基因载体选择、构建；③目的基因与载体拼接；④重组DNA分子导入受体细胞；⑤筛选重组体⑥目的基因的表达。重组DNA技术（recombinantDNA）又称基因克隆（

5、genecloning）（二）工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶ⅠTaqDNA聚合酶逆转录酶T4DNA连接酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)定义识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ切割DNA后产生含5’磷酸和3’羟基的末端Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGGTCCAGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口BamHⅠGCCTAGGATCCG+GGATC

6、CCCTAGG粘端切口异源同功酶，同裂酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶酶不同、识别序列不同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA酶不同、识别序列相同，产生相同的粘性末端，称为同功异源酶。酶不同、识别序列不同，产生相同的粘性

7、末端，称为同尾酶。（二）DNA聚合酶DNApolI：klenow片段：TaqDNApolPCR反应（三）DNAligaseDNA相邻的5’-P和3’-OH之间形成磷酸二酯键，切口封合或片段连接。1、T4DNAligase：催化相同黏性末端或平头末端的DNA分子的连接。2、大肠杆菌DNAligase:催化相同黏性末端的连接.二、基因工程的载体定义vector为携带外源DNA进入宿主细胞（无性繁殖或表达）的工具（DNA分子）。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达