《基因工程讲》PPT课件

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1、第四章哺乳动物基因工程一、哺乳动物基因转移的遗传选择标记迄今为止，已知的绝大多数的哺乳动物病毒载体，除了牛乳头病毒载体外，都得附加上标记基因，才能进行有效的选择。常用的这些标记基因有：胸苷激酶基因(tk)、二氢叶酸还原酶基因(dhfr)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Eco-gpt)以及细菌的新霉素磷酸转移酶基因(Eco-neo）等。哺乳动物基因转染实验常用的显性选择标记1．嘌呤和嘧啶的生物合成（1）嘌呤的生物合成APRT：腺嘌呤磷酸核糖基转移酶；HGPRT：次黄嘌呤-

2、鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶；XGPRT：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。（2）嘧啶的生物合成2、胸苷激酶基因选择系统(1)TK-细胞胸苷激酶(thymidinkinase，TK)是核苷酸合成代谢途径中的一种酶，能够把胸苷转换为胸苷一磷酸。在单纯疱疹病毒(HSV)中发现的胸苷激酶的编码基因(tk)，几乎在所有的真核细胞中都能有效地表达。正是由于这种缘故，以确定哺乳动物基因转移可能性为目标的大多数早期实验，都是采用这个基因作为遗传选择标记。在胸苷激酶基因选择系统中，首先得建立具TK-表型的细胞株。这可以通过诱变加选择的程

3、序获得。具体的做法：把细胞培养在补加有一种胸苷类似物5-溴尿嘧啶脱氧核苷(BUdR)的培养基中，在胸苷激酶的催化下，BUdR便掺入到细胞的DNA分子上，致使DNA复制出现错误。具有BUdR-DNA的细胞对UV特别敏感，被迅速地杀死，而少数突变的TK-细胞便能够存活下来。应用这种方法已经分离到许多种培养细胞的TK-突变体。目前最常用的一种TK-细胞是小鼠L细胞的TK-突变株。这种突变株的优点是产生回复突变的频率相当低，而且容易被外源DNA所转化，所以使用起来很方便，即便在不使用tk基因作选择标记的情况下，也可用作受

4、体细胞。(2)HAT选择法由于选择TK+细胞的培养基含有次黄嘌呤(hypoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(thymidine)，所以叫做HAT选择法。基本原理：如果用叶酸的类似物氨基蝶呤(APT)处理细胞，二氢叶酸还原酶便被抑制，培养基中的还原辅助因子四氢叶酸因得不到补充而逐渐耗尽，于是从dUMP合成dTTP，以及dATP和dGTP的重新合成便因此被阻断。但次黄嘌呤是dATP和dGTP补救合成途径的一种底物，培养基中补加有此种物质时，细胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用，继续合成出这些脱氧嘌

5、呤三磷酸(dATP和dGTP)。由于在HAT培养基中补加有外源的胸苷，所以TK+细胞通过胸苷激酶的作用可把它合成为dTTP，继续存活下去；而TK-细胞则不会发生这种合成，因而死亡。把正常的tk基因导入TK-细胞，它们也就照样能够存活下去。所以使用HAT培养基，能够选择出由tk基因转化而来的TK+细胞。(3)共转化选择1)共转化选择的基本过程HAT选择法可以用来分离以tk基因作选择标记的外源DNA转化的受体细胞。在磷酸钙沉淀中，两种DNA分子的混合物，能够同时转化受体细胞。根据这种共转化现象，结合磷酸钙共沉淀技术，

6、人们可以将无选择标记的DNA同具tk选择标记基因的DNA进行混合转化，发展出了共转化选择体系，从而解决了不具tk选择标记基因的转化子的选择问题。3．二氢叶酸还原酶基因选择系统(1)基本原理二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase，DHFR)在真核细胞的核苷酸生物合成中起着重要的作用，它催化二氢叶酸(DHF)还原成四氢叶酸(THF)。这个反应过程受到叶酸的类似物氨基蝶呤(aminopterin，APT)和氨甲蝶呤(methotrexate，MTX)的竞争性抑制。如果细胞的培养基中含有这些抑制物，

7、例如氨甲蝶呤，其浓度只要达0.1µg／ml，就会阻断核苷酸生物合成，最终导致细胞死亡。（2）常用的基因:1)小鼠3T6成纤维细胞的突变系3T6—400来源的突变dhfr基因。由它合成的突变二氢叶酸还原酶与正常酶相比，同MTX的结合能力下降了270倍。因此，用突变细胞呈抗性反应的MTX浓度，就可以把野生型细胞杀死，达到了显性选择的目的。如果把突变基因dhfrMTX导入正常的细胞，转化子也就获得了抗性。2)另一个dhfr显性选择标记是位于细菌抗药性因子R388上的dhfr基因。它编码的二氢叶酸还原酶，实际上就可以抗M

8、TX的抑制作用。4．氯霉素乙酰转移酶基因选择系统氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicolacetyltransferase，CAT)是由大肠杆菌Tn9转座子上的cat基因编码的，它能够催化乙酰基团从乙酰辅酶A转移到氯霉素分子上，导致一个或两个羟基发生乙酰化作用，从而使其失去活性。这个基因可以作为检测外源基因导入真核细胞的一种十分敏感的标记基因，尤其是适用于瞬时表达