第3讲 基因工程的酶学基础ppt课件.ppt

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1、生物技术核心课程PrinciplesofGeneticEngineering基因工程原理生命学院遗传与基因工程教研室余丽芸教授博士基因工程原理纲要第一讲基因工程概论第二讲基因工程的主要技术第三讲基因工程的酶学基础第四讲基因克隆的载体与受体第五讲目的基因的克隆与分离第六讲克隆基因的检测与功能鉴定第七讲克隆基因的表达与产物纯化第八讲基因表达的调控用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸外切酶核酸修饰酶第三讲基因工程的酶学基础单链DNA内切酶核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导

2、致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。其中专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶(RNase)，而特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶(DNase)。按水解断裂核酸分子的方式不同，可分为两种类型：一类是从核酸分子的末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫核酸外切酶(exonuclease)；另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫核酸内切酶(endonuclease)。第一节限制性核酸内切酶一、基本概念及其生物功能限制性核酸内切酶(Restrictionendonuclease)是一

3、类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。第一节限制性核酸内切酶一、基本概念及其生物功能据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》统计，仅II型限制性核酸内切酶就已从各种不同的微生物中分离出了2300种以上，可识别230种不同的DNA序列。2.性质内切酶。主要是从原核生物中分离纯化出来。即在核酸分子链的内部制造切口的酶。帮助细菌限制外来DNA的入侵3.功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1.来源限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制（Re

4、striction）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基I型限制性内切酶目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型II型限制性内切酶III型限制性内切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。（1）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)

5、6GTGC1.I型限制性内切酶如EcoB和EcoK。未甲基化修饰的特异序列。需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位点1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox首先从流感嗜血杆菌d株中分离出来。（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。与DNA的来源无关。2.II型限制性内切酶分离的第一个酶是HindII，其次是HindIIIEcoRI

6、5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端（2）切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：识别位点处。（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：①5’端凸出（如EcoRI切点）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5

7、’--3’3’--5’EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPOHPCTGCAG②3’端凸出（如PstI切点）GACGTC5’--3’3

8、’--5’5’--3’3’--5’CTGCAGGACGTCPstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-