克隆及诱导蛋白步骤

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1、1植物RNA提取使用天根植物RNA快速提取试剂盒提取棉花RNA，详细步骤见说明书。核酸分析仪分析RNA浓度1.打开软件ND-1000V3.5.1，选择“Nucleicacid”；2.擦拭加样处，用DEPC水清洗（1μl）之后点击“OK”;3.选择“RNA”，擦拭，再加1μlDEPC水作空白，点击“Blank”；4.擦拭进样口，吸1μlRNA样品，点击“Measure”,记录结果；5.擦拭，吸取1μlDEPC水清洗进样孔，点击“Blank”，再次进样，重复步骤4.6.记录结果:A260/A280;A260/A230

2、;ng/μlA260是核酸最高吸收峰的吸收波长A280是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长A230是碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂的吸收波长A260/A280的比值在1.6~2.0之间，表明没有蛋白质污染A260/A230的比值在2.0~2.4之间，表明没有盐类小分子污染剩余RNA放-80°冰箱保存或继续进行试验2基因克隆根据转录组及基因组注释的目的基因ORF序列，合并同源基因，设计了引物，以期获得全部家族基因。处理的棉花叶片提取RNA，反转录天根快速反转录试剂盒合成第一链cDNA无RNase离心管1.各试剂

3、使用前混匀并短暂离心；2.gDNA去除体系，混匀，短暂离心，置于42℃3min后置于冰上。TotalRNA约1500ng5×Buffer3μlRNaseFreeddH2O补足到15μl3.反转录反应体系10×FastRTBuffer3μlRTEnymeMix4μlFQ-RTprimerMix2μlRNase-Free7.5μlTotal15μl4.取3混合液加到2步溶液中，混匀，并轻微离心；5.42℃孵育15min，95℃孵育3min放到冰上。得到cDNA用于后续试验。-20℃保存。PCR检测模板Taqmix10

4、μlACT-jianceF0.4μlACT-jianceR0.4μlT1μlddH2O8.2μlTotal20μlPCR程序94℃4min94℃30s55℃30s38cycles72℃30s10℃∞做胶，跑胶若条带在400-500bp之间，说明模板可用克隆，P基因或做荧光定量检测目的基因表达上调或下调。（实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。检测方法1.SYBRGreenⅠ法:在PCR反应体系中，加入过量S

5、YBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔解曲线图(单一峰图表明PCR扩增产物的单一性2.TaqMan探针法:探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光

6、信号的累积与PCR产物的形成完全同步。）做蛋白功能接下一步Pfu高保真酶5XHFBuffer5μldNTP2.5μlPfu0.5μFP0.5μlRP0.5μlT3μlddH2O13μlTotal25μlPCR程序94℃4min94℃30s℃30s35cycles72℃s10℃∞电泳，若条带符合序列长度，则进行胶回收。胶回收1.在紫外灯下切含目的的基因胶；2.加500μlBufferDE-A混合后75℃6~8min至胶熔化；3.加250μlBufferDE-B混合(目的片段＜400bp，加1体积异丙醇)变黄色，准备

7、DNA制备管，置于2ml离心管中；4.吸取3中混合液于DNA制备管中，离心12000r/min，30s，弃滤液；5.制备管重置2ml离心管，加500μlBufferW1(除去蛋白质)，离心12000r/min，30s，弃滤液；6.加700μlBufferW2(除去离子、盐)，离心12000r/min，30s，弃滤液，弃废液后以同样的方法再用BufferW2(除去离子、盐)洗涤一次，离心12000r/min，1min，弃滤液；(确定在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇，两次冲

8、洗，使用BufferW2能确保盐分被完全消除，消除对酶切反应的影响)7.将制备管置回2ml离心管中，离心12000r/min，空离1min;8.将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中加入20μl去离子水ddH2O,室温静置1min，离心12000r/min，1min,洗脱DNA。（将去离子水加热至65℃，提高洗脱效率）连接PEASY-T3(Blunt)连接快连吹