免疫荧光原位杂交技术FISH.pdf

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1、FISH什么是FISH?hays荧光原位杂交（FluorescenceinsituHybridization，FISH）基本原理：应用荧光染料标记探针DNA，变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交，在荧光显微镜下观察并记录结果。概述FISH探针种类CSP着丝粒探针GLP特异性位点探针FISH诊断的优势快速出结果操作简单FISH灵敏度特异性标本来源丰富高准确率高FISH在石腊切片标本中的应用FISH在产前诊断的应用FISH结果分析及注意事项石蜡切片标本处理基本步骤：梯度乙二甲苯醇复水沸水煮脱蜡30min2XSSC2XSSC37ºC变性杂交漂洗2次梯度漂洗2次蛋白酶k

2、脱水5-30minDAPI染色洗片阅片脱蜡石蜡切片浸于二甲苯中3次,每次10分钟浸入100%的乙醇中5分钟.然后梯度复水各2分钟浸入去离子水3分钟(脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交率降低,荧光背景高等)预处理I.100ºC沸水处理组织切片30分钟II.100ug/mL的蛋白酶K溶液,37ºC孵育5-30分钟III.2*SSC漂洗,梯度脱水各2分钟,干燥玻片.83ºC5min•探针变性变性杂交•玻片变性42ºC湿盒孵育过夜•50%甲酰胺•2XSSCDAPI复染洗涤•0.1%NP-40•75%乙醇羊水处理的步骤•悬液玻片制备•滴片及预处理•加探针变性杂交•变性杂交过•荧光显微镜

3、下观察计数结果统计羊水标本玻片的制备离心胰酶消化低渗（0.075MKCL）预固定、固定滴片（控制好悬液浓度、量、高度）胰蛋白酶（Trypsin）消化操作中要控制好酶的工作浓度,适量加大酶有助于加强消化作用,但盲目加大酶量超过酶饱和度不一定起到加强消化的作用。实验中应控制好酶的工作浓度,不同批次、不同储存时间及温度影响酶消化强度及饱和度。低渗处理和固定细胞置于KCL低渗溶液中吸收水分可使细胞胀破，使探针更容易与核内DNA杂交结合，便于结果分析。固定液（乙酸和甲醇1：3配比）加入后形成核蛋白交联定型。提高细胞核与载玻片的亲和力，使探针DNA易于进入细胞。预处理•37ºC

4、PBS5min•37ºC0.005%胃酶15min•1xPBS3min•1%多聚甲醛10min•1xPBS3min2次•梯度脱水胃蛋白酶处理胃蛋白酶处理可以取出细胞浆中的蛋白质，减少探针在载玻片上与核酸和蛋白质的非特异结合，提高杂交效率。变性杂交变性使DNA变性保持单链结构杂交湿润密闭环境结果分析洗涤DAPI复染镜下观察计数FISH结果分析及注意事项FISH成像分析系统荧光显微镜的使用自己眼睛的保护。汞灯/氙灯的使用和保养。标本荧光信号的保护。AF细胞观察计数及结果分析100X油镜下选择探针杂交充分，不重叠的细胞计数50个阳性：异常细胞比率占60%以上阴性：

5、正常细胞比率占90%以上无法判断：没达到以上标准，可扩大计数范围HER-2细胞观察计数及结果分析100X油镜下浸润区随机计数30个细胞，计算红绿信号的比值（Ratio）阳性（扩增）：I:Ratio>2.2II：成簇扩增阴性：Ratio<1.8无法判断：Ratio在1.8-2.2之间，分析更多细胞或重复实验HER-2基因扩增模式肺癌细胞观察计数及结果分析100X油镜下癌区随机计数100个细胞，计算红绿信号的比值（Ratio）扩增：I:Ratio>2II:15copy>或=10%III:成簇扩增IV：Ratio<2但4copy>或=40%阴性：除以上扩增的情况EGFR

6、基因扩增检测试剂盒（FISH）无荧光信号没有用酶进行处理,用了不恰当的滤光镜镜下观察可能出现的问题没有加入探针(或探针没有经过适当变性),杂交条件不够恰当探针不合格(或探针没有适当保存),荧光显微镜没有适当地起作用荧光信号微弱杂交条件不够充分探针过分稀释造成浓度太低,没有适当变性,探针和杂交液没有充分混合,洗涤条件不够恰当(或洗涤太过),滤光镜不对有背景荧光杂交后洗涤不够充分洗涤缓冲液盐的浓度过高洗涤时温度过低荧光信号计数问题选择分散较好不重叠的细胞计数IGH/CHER-2HER-2扩增C-MYCCBFB基因断裂重组检测试剂盒探针：GLPCBFBCBFB基因（Corebindin

7、gfactorβ，CBFB）：核心结合因子,位于16号染色体上。CBFB也是早期造血所必需的转录因子，通过与AML1的Runt同源结构域结合，由AML1将其带至胞核，增强AML1与DNA的结合能力，使AML1依赖的基因转录得以进行。处理较好的细胞DAPI通道绿通道红通道蓝通道串色叠合照片绿通道（X染色体）蓝通道（18染色体）谢谢