RT-PCR基本步骤

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1、实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1．内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异,因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。2．实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量P

2、CR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标

3、准曲线定量的方法。RT-PCR步骤总RNA提取1.取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。2.震荡30s。3.加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。4.12000×g，4℃离心，15min。5.吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6.加等体积异丙醇，-20℃，30min。7.12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀8.弃上清，加75％乙醇1ml，振荡。9.7500×g，4℃离心，10min。10.弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5－10min。11.沉淀溶于20μlDEPC水，取1μ

4、l加入79μlDEPC水测OD260/OD28012.计算浓度与纯度，－70℃保存。　　　　　　　OD260×40×稀释倍数RNA浓度（μg/μl）＝────────────1000逆转录合成cDNA反应体系如下━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━MgCl22μl10×RTBuffer1μlRNaseFreedH2O3.75μldNTPMixture(各10mM)1μlRNaseInhibitor0.25μlAMVReverseTranscriptase0.5μlRandom9mers0.5μlPositiveControlRNA(1μ

5、g)1μl混匀快速离心一次反应条件如下30℃10min42℃30min99℃5min5℃5min-20℃冰箱冻存PCR反应━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━摸板cDNA2.5μl5×PCRBuffer2.5μl灭菌蒸馏水7.2μl聚合酶ExTaqHS0.1μl上游引物0.1μl下游引物0.1μl　─────────────────────────────　Total12.5μl混匀快速离心一次反应条件94℃2min1Cycle94℃40sec┓50-65℃40sec┃25-35Cycles72℃1min┛72℃5min1CyclePCR产物-20

6、℃冰箱保存取PCR产物8μl　加5×LoadingBuffer2μl2%琼脂糖凝胶电泳120V100mA30min溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果