RT-PCR实验步骤

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1、RT-PCR注意：酶现拿现用，用完放回—20度先配后加，节约枪头试剂用前弹一下，再甩一下，再用；每次加液也是如此一、DNase处理：1、10ul体系TotalRNA1ug（或者2ug）Aul10*buffer（含Mgcl2）1ulDNase（1U/ul）1ulDEPCfreewater补足总体积10ul即为8-Aul总体积：10ul37℃，30分钟即DnaseⅠ2、加入25mM的EDTA（终止DNA酶活性）1ul，（可以不加，无太大影响）65℃，10min，即DnaseⅡ备注：这一步后，共有11ul的产物，取10ul进行一下的步骤，留取1ul作为对照

2、，将这个1ul的留样用1ul的水稀释。二、逆转录（以下为20ul的体系，如果样品过多，或者不同体系可以等比加样）1、加入，并混匀1)总RNA（含有1-2ugRNA，或者是10ul的第一步中经过DNase处理的总RNA）10ul2)Primeroligo（dt）18（0.5ug/uL）1ul3)dNTP（10mM）1ul总体积：12ul65℃，5min，立即取出放置在冰上（保持开链状态）即程序cDNAⅠ2、加入，并混匀5xfirstbrandbuffer4ul0.1MDTT2ulRNA酶抑制剂（20U/uL）1ul总体积：19ul37℃，5min（若用

3、随机引物，则25℃，5min）即程序cDNAⅡ3、不等其降到4度，立即加入200U的逆转录酶，RevertAidTMM—Mulv1ul总体积：20ul37℃，60min即程序cDNAⅢ4、70℃，10min，终止反应，冰上冷却。注意：1)RT的步骤中的温浴可以用PCR仪来完成2)RT每步温浴前要稍微离心3)推荐的做法是DNase处理完后的RNA留用1ul，用来最后PCR的时候做对照，以排除可能的DNA污染。三、PCR取逆转录的产物做PCR，参照普通的PCR。regularPCR备一套新PCR反应管，按顺序加入以下物质20ul体系：1份2份3份4份5份

4、6份10xbuffer2ul4ul6ul8ul10ul12ulMgcl21.6ul3.2ul4.8ul6.4ul8.0ul9.6uldNTP2ul4ul6ul8ul10ul12ul上游引物0.4ul0.8ul1.2ul1.6ul2.0ul2.5ul下游引物0.4ul0.8ul1.2ul1.6ul2.0ul2.5ulH2O10.6ul21.2ul31.8ul42.4ul53.0ul63.6ulTaq酶1ul2.0ul3ul4ul5ul6ulcDNA2ul4ul6ul8ul10ul12ul注意：1)先加H2O10.6ul，加样品DNA2ul/个（普通枪头

5、即可）2)剩下的全部加在一个普通的EP管内（即除了H2O，DNA外其他的组分先混再加）。3)每个管里面加入20-10.6-2=7.4ul混合物或者：2xTaqmix10ulDEPC水7ul引物2ul（上游引物和下游引物各1ul）DNA模版1ul程序(约1.5h)：95℃2min—（94℃30s；60℃30s；72℃1min，35cycles)—72℃10min，4℃∞。注意：1)PCR中需要修改的主要是退火温度和延伸时间，2)退火温度一般为60度，计算可用引物Tm（1mM）值—5度，取所有引物中的最低值；3)延伸时间一般普通PCR为1min，qPCR

6、为30min电泳1.配制凝胶：选择合适的浓度0.8-1.5%(1Kbp质粒-300bpPCR产物)如0.6%凝胶：0.3gagarose+50ml0.5TBE2.煮胶（中火3min，放置到室温约40度）（中高火2min）3.灌胶：选择合适的孔道数，在胶中加入EB替代物（母液为1万X），混匀后加入板中，不要产生气泡。4.上样：样品中加入6Xloadingdye，混匀后加入孔道中，另外需要加入DNAmarker5.跑胶：根据目的不同，选择时间，电压通常是150（小槽），180大槽，从黑色负极向红色正极跑。6.到时间后，加入凝胶成像仪进行照相，观看，分析等

7、操作。（跑胶时，用专用的透明手套和垃圾桶）注意：如果使用Taqmix跑PCR，则不需要加loadingbuffer。