RT-PCR操作步骤

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1、RT-PCR操作步骤（2008/11/7整理，ZLJ）原理：Trizol是由酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液，酚起到变性的作用，使蛋白变性，异硫氰酸胍可以抑制RNA酶，防止RNA的降解。（一）试剂准备1．Trizol试剂2．氯仿、异丙醇、无水乙醇（国产色谱纯）3．三蒸水（娃哈哈）4．75%乙醇（DEPCH2O配制）ü(用于擦枪等)0.1%DEPCH2O配制。无水乙醇500mL,倒出200ml，加入100ml的0.1%DEPCH2O。ü（用于RNA洗涤）0.01%DEPCH2O配制。无水乙醇500mL

2、,倒出200ml，加入100ml的0.01%DEPCH2O。5．DEPCH2Oü0.1%DEPCH2O(用于处理枪、枪头盒)。用三蒸水配制。加入体积0.1%的DEPCü0.01%DEPCH2O(用于RNA提取最后一步)三蒸水配制,加入体积0.01%的DEPC.盖上胶塞,过夜,高压灭菌.6．PBS配制100ml，专门用于该实验。7．TE缓冲液8．反转录试剂盒（MBI）9．Taq酶——耐热DNA聚合酶（TakaraJapen）10．dNTPs(TakaraJapen)11．溴酚兰12．Marker（

3、二）耗材准备1．Rnase-free塑料EP管。直接使用。2．一次性PE手套（3包）3．三种规格枪头ü处理：枪头及枪头盒，镊子、及4ml国产EP管放入饭盒中，加入0.1%DEPCH2O，浸入后，盖厚纱布，将处理的物品压入水中，盖上饭盒盖，自封袋封好，室温过液。烘干。灭菌30分钟。（三）RNA提取一步法提取细胞总RNA准备试管架、1.5mlEP管架、2套1.5mLEP管、4mL处理过的EP管（数目同样品数）所有EP管标号1．收获细胞，移入4mL离心管（处理过）中，1000转离心5min，PBS洗一

4、遍。2．每加入1mlTrizol,枪头反复吹打，移入1.5mLEP管中，室温静置5min。不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。1．加氯仿200微升，盖好，剧烈震荡15秒。室温放置2-3分钟，4℃12000g 离心15分钟。2．仔细吸取上层水相（约500μL,枪调到170μL，吸三次），移到另一套1.5mLEP管中。3．加500微升异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min.4．4℃离心，12000g，10min,弃上清。5．加入1ml

5、75%乙醇（0.01%DEPC处理过的），轻轻洗涤沉淀。4℃,7500g,离心5min。尽可能吸走上清液6．室温下挥干（5-10分钟），注意不能完全干燥。加0.01%DEPCH2O40μL,吹打溶解，56℃水浴助溶10分钟。-70℃冰箱保存。（一）紫外吸收测定法分析RNA浓度、纯度RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用DEPCH2O稀释DNA样品n倍并

6、以DEPCH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品翻译前的浓度。操作步骤：用DEPCH2O种类稀释RNA（稀释600倍），即吸收10μLRNA，加入TE溶液1990，稀释200倍，读取其在分光光度260nm和280nm处的吸收值，以DEPCH2O调零。样品RNA浓度（μg/ml）计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/mL，根据RNA浓度测定的结果将总RNA配制成1μg/ml。（A260*8μg/μL）用0.01%DEPC水稀释成1μg/μL的样品RNA浓度RNA溶液的A26

7、0/A280的比值检测RNA纯度，比值范围应在1.8-2.1之间。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。（二）RT合成cDNA第一链（按照试剂盒操作说明进行，MBI）1．取样品总RNA2μL随机引物1μL加DEPCH2O（9μL）到总体积12μL离心3-5秒（掌上离心机）2．65℃，5分钟；0℃forever离心3-5秒3．冰上操作（以下事先混合好，分别加入各种样品中8μL）加入5×reactionbuffer4μLRibonLockTMRibonucleaseinhi

8、bitor1μL10mMdNTPmix2μLRevertAidTMM-MuLVReverseTranscripase1μL6.25℃5分钟，42℃60分钟7．70℃5分钟，4℃forever。CDNA储存在-20℃冰箱里。（一）PCR反应及检测PCR扩增反应体系25μL：（按照顺序加入PCR管中）1ststrandcDNA1μL以下配好后，一起加入24微升10×PCRBuffer2.5μLdNTPmix2μL(2.5mM×2μL)引物（含目的基因及DAPDH上、下游引物10pmol）1μL（80