《电镜超薄切》PPT课件

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1、（5）包埋(embeding)：目的:包埋的目的是让包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片的各种力的作用，有利于切薄片。包埋剂的性质:①粘度适中，有良好的切割性能。②能耐受电子束的轰击，高温不易升华、不变形。③透明度好。④对人无害。包埋剂的种类①环氧树脂类：目前国内使用较多的环氧树脂有进口的Epon812和国产的618。原理:环氧树脂具有环氧基和羟基两个主要化学反应基团，环氧基是线型聚合物的末端，易与其它含活性氢原子的化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。而单体中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连

2、接。因此，将环氧树脂、胺类和酸酐三者按比例混合，在一定温度条件下，可形成具有三维空间结构的交链状聚合物。这种聚合物收缩率小、均匀，组织损伤小，耐电子束的轰击。包埋后可保存细胞内的微细结构。其缺点是粘度较大，操作不便、切片较为困难，而且反差较弱。②低粘度包埋剂(Spurr)为适应临床诊断电镜的需要，目前低粘度包埋剂的应用已日趋广泛。这是一种低粘度的树脂，能较好地渗入组织内部，对组织结构保存好，耐电子束轰击，可广泛应用于各种生物材料，尤其适宜于较致密的组织。③水溶性包埋剂：是进行细胞化学研究较理想的包埋剂。原理:水溶性包埋剂可以在较低温度的紫外线照射下进行聚合

3、，避免了一般包埋剂必须在高温下聚合而给酶活性带来的破坏，所以是酶活性定位和定量研究十分优良的包埋剂。包埋剂:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂(简称GMA)、聚乙二醇、Aquon等④所加的固化剂，有十二烯基虎铂酸酐（DDSA）和甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐（MNA）,增韧剂为邻苯二甲酸二丁酯（DBP）,加速剂为2,4,6,一三苯酚（DMP—30）。1环氧树脂的性能和配制：618树脂5ml十二烯基丁二酸酐DSA（固化剂）5ml苯二甲酸二丁酯DBP（增塑剂）0.3ml2,4.6三苯酚称DMP30（加速剂）0.1ml60oC烘箱内加温使粘度下降，用量杯量取所需要

4、的量，一次加入固化剂、增塑剂、加速剂，边加边搅拌，最后充分搅拌10分钟，至37oC温箱中使气泡逸出。Epon812的配制A液：Epon81262mlDDSA(固化剂)100mlB液：Epon812100mlMNA(固化剂)89mlA液和B液分别配制，使用时用不同比例将二者混合后再加1.5%DMP-30(加速剂)即可。A液和B液的比例：冬季2：8。夏季1：9。B液可以增加包埋块的硬度。1）包埋的方法常规包埋①将浸透在包埋剂的组织块，转移到包埋囊中，使之位于囊的中央，然后加包埋剂。②把写好标本块编号的小纸条卷成环状，放入囊中，插入包埋剂中。③不加盖，37oC过

5、夜，这也就是纯包埋剂浸透。④次日，升温到60oC48小时固化。⑤固化完毕，关温箱，自然冷却。⑥去掉外壳，取出组织包埋块将组织包埋块，存放在干燥器中。定向包埋：注意事项①防潮、干燥。②包埋剂要充分混匀。③防气泡。④包埋后立即清洗器皿。⑤自身保护。⑥干燥器中存放包埋块。思考题1、试说明显示酸性磷酸酶有几种方法？2、试设计在超微结构水平显示周期抑制蛋白P53的实验方法和步骤。（6）切片1）选择和清洗载网。常用的载网有圆形的铜网，细胞化学和免疫组织化学常用镍网、不锈钢网和银丝网。直径为3mm，目数为200-3002）支持膜的制备：①福尔莫瓦膜：常用氯仿配制的0.2

6、%-1.5%的聚乙烯醇缩甲醛液（formrar）。注：制膜时室内的温度小于60%，否则会出现白点。②火棉胶膜：特点，火棉胶膜的机械强度比福尔莫瓦膜弱，但制作容易。常用1-2%醋酸异戊酯溶液采用漏斗法和贴附法制膜。③帕罗丁支持膜：目前国外比较常用，一般配制30%左右的帕罗丁醋酸戊酯溶液制膜，方法同火棉胶同。④碳膜：炭膜的机械程度和稳定性较好，适用于高分辨率的观察，用真空喷镀仪采用碳升华喷镀法制备。⑤复合膜：有机膜上喷镀5-10nm的碳膜。⑥微孔支持膜：高分辨率观察使用。2）包埋块修整：修成四面锥体（45oC角）5）超薄切片机的构造6）切片操作7）切片厚度:灰

7、色40-50nm银灰色50-70nm金黄色70-90nm紫色90nm以上(7)染色1）常用的电子染色剂醋酸铀(UO2(CH3COO)2.2H2O：特性：具有放射性和毒性，对光不稳定，储存、染色最好闭光，变混则失效。广泛使用，能产生较高的反差。主要是提高核酸、核蛋白和结缔组织纤维成分的反差；对糖分、分泌颗粒、溶酶体等也能染色，但对膜的结构染色较差。常用浓度：50%-70%的乙醇或丙酮配制的2%-3%的溶液。染的时间：组织块染色时间为1-2h或过夜。片染30min即可。枸橼酸铅（leadacetate）：特点：①毒性大。②与空气中的二氧化碳结合形成白色的碳酸铅

8、沉淀。③高PH（11-12）染色效果好。也是目前最广泛使用的染色液