透射电镜超薄切片步骤

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1、1玻璃刀(glassknife)與刀口水槽(trough)製作玻璃刀需於切片當天製作，請於切片當天預留0.5-1h。方法步驟：1)首先取一乾淨的玻璃條，粗造面朝下(由玻璃條側面觀之)。利用製刀機將玻璃條(glassstrip)切割成一英吋大小的正方形，再由對角線(約略偏斜)切割一裂痕，自兩側及底部加壓使玻璃斷裂為二即成。理想的刀口應呈現平整均勻，在解剖顯微鏡下無鋸齒狀缺刻(圖1.5.1)。施加壓力於經鑽石刀劃過的玻璃條時，需慢慢的添加壓力。當切口出現一半月型的陰影或白影(視觀察角度而定)時，即停止繼續增加壓力，使切口自行持續擴大至斷裂。經此過程

2、做出的玻璃刀有較佳的品質。圖1.5.1玻璃刀的製作(A)LKB700製刀機。(B)利用製刀機上的鑽石刀在玻璃條上略做切割。(C)旋轉製刀機右側旋鈕，自玻璃條兩側及下方均勻施加壓力，使其斷裂。(D)及(E)每一正方形玻璃條可製作2把玻璃刀，每把刀各自有刀鋒及刀座。第一把刀的刀鋒恰好緊鄰第二把刀的刀座。(F)製作完成的玻璃刀可以在顯微鏡下檢查刀鋒部分，理想的刀鋒應為平滑無缺刻。整把刀最適合切片的部分為Z區，約佔1/3；S區不用於切片；而E區的使用需視刀鋒的品質而定。(圖片A-C,E取自生物電子顯微鏡學,圖片D,F取自MethodsofPrepara

3、tionforElectronMicroscopy,AnIntroductionfortheBiomedicalSciences)2)將銀膠帶的一端貼於刀口下方並與底部平行後，另一端圍繞成一平滑的弧形貼於另一側，圈出一船型水槽。過程中勿用手接觸用以形成水槽，帶有黏性的膠帶面，以免將手上的油脂黏於其上(圖1.5.2A-B)。3)以刀片沿玻璃將多餘的膠帶切除，然後於水槽下緣與玻璃刀接觸面以蠟或指甲油封合，避免水滲漏(圖1.5.2C)，待乾燥後即可使用。圖1.5.2刀口水槽的製(圖片取自生物電子顯微鏡學)2、樣品塊修整(trimming)包埋完成後的

4、樣品塊須先經過修整，將樣品塊尖端修整成適當的大小及形狀,並將要觀察的部份露出。習慣上將樣品塊修整成平頂的金字塔型(從側面觀察)，頂部與底部略成梯形(從上方觀察)，大小應小於0.5mm，金字塔高度不宜超過0.2mm。將樣品塊修整成平頂的金字塔型，是為了讓樣品在切片過程中得到最佳的支持力。高度過大，切片時容易發生震動，在切片上留下深淺交替的平行條紋，或導致樣品塊前端斷裂。較小的樣品塊切面較容易進行超薄切片，但過小的切片在電子顯微鏡下可觀察到的東西較少。方法步驟：1)將樣品塊放置在解剖顯微鏡下，以刀片(two-edgedrazorblade)水平的削

5、去尖端直到組織露出(圖1.4.1,步驟1)。2)修出梯形的上下底。先將刀片以垂直方向切下，再將刀鋒以水平朝向自己的方式緩慢前進，至前一刀垂直切下處即可除去不要的部份(圖1.4.1,步驟2-3)。注意力量的控制。3)修出梯形的兩邊，方式同上(圖1.4.1,步驟4-5)。4)待初步形狀出來後，換一新刀片再做更細微的修整，盡量使上下底平行，切面光滑無缺刻。此步驟會影響連續切片(ribbon)的形成。圖1.4.1樣品塊修整(圖片取自MethodsofPreparationforElectronMicroscopy)3、半薄切片（1-2um)、光学显微镜

6、定位4、刀槽及液面的调节超薄切片只有漂浮在水面上或其他合适的液面上才便于收集、伸展和捞取，为此在刀口背部装上一个小的水容器，通常称为“刀槽”。通常用定制的硬塑料刀槽架或用一小段医用橡皮胶缠绕过刀背，紧紧地粘在玻璃上，橡皮胶的后下部分用融化的牙科用红腊密封，以防漏水。注意橡皮胶的顶端不应高出刀刃。切片前在刀槽内加入双蒸水，使切后的切片漂浮于液面上。液面的调节一般先加稍过量的液体使之凸起，以保证浸湿刀刃。然后在双筒解剖镜下用注射器或移液管慢慢吸去一部分液体，调整照明系统，当液面变成凹面、可见一反射光线的弧面，即为正确的液面。从这一光亮的反射光可看到

7、切出的片子。在切片过程中由于液体蒸发，需加液以保证正确的液面。5、超薄切片切片时将夹着修好组织块的样品夹安装在切片机的样品臂上，刀台上装好玻璃刀，其高度要与刀台上的标准规等高，后斜角一般在3～5°，在显微镜下使样品块面的上下两条平行边与刀刃平行，如是梯形的应长边在下面。调整好刀刃和组织块的距离，再在刀槽内注入适量的双蒸馏水。将切速放在2～5mm／秒，调节控制切片厚度的电流表，即可切片。当切片停止时，立即打开电吹风，冷却样品臂。捞片后关掉电吹风又可重新切片，或更换新刀。切片厚度的判断。一般是利用反射光干涉色来判断切片的厚度，即从切片表面反射的光和

8、从切片下面的水面的反射光发生干涉现象（见下表）。当用白光时，从双筒显微镜下观察两种光线间的差别。目前公认的树脂包埋切片厚度与干涉色的近似值干涉色切片厚