生化药物制造工艺酶类药物

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1、第四节酶类药物一、酶类药物的原料来源（一）原料选择选料应注意以下几点：（1）不同酶的原料选择。（2）注意不同生长发育情况及营养状况：微生物制酶，故需测其活力来决定取酶阶段。要考虑动物年龄及饲养条件等因素；（3）从原料来源是否丰富考虑；（4）从简化提纯步骤着手。（5）如用动物组织作原料，则此动物宰杀后应立即取材。从动物或植物中提取酶受到原料的限制。用微生物发酵法生产药用酶，不受季节、气候和地域的限制，生产周期短，产量高，成本低，能大规模生产。（二）微生物酶制剂高产菌株的选育菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。目前，优良菌种的获得有三条途径

2、：①是从自然界分离筛选；②是用物理或化学方法处理、诱变；③是用基因重组与细胞融合技术。微生物的分离筛选是一切工作的基础。（三）微生物酶制剂生产的发酵技术有了优良的生产菌株，只是酶生产的先决条件，要有效地进行生产还必须探索菌株产酶的最适培养条件。首先要合理选择培养方法、培养基、培养温度、pH和通气量等。在工业生产中还要摸索一系列工程和工艺条件，如培养基的灭菌方式、种子培养条件、发酵罐的型式、通气条件、搅拌速度、温度和pH调节控制等。还要研究酶的分离提纯技术和制备工艺，这些条件的综合结果将决定酶生产本身的经济效益。二、酶类药物的提取和纯化（

3、一）生物材料的预处理一般应避免剧烈处理，但如是结合酶，则必须进行剧烈处理。1、动物材料的预处理（1）机械处理用绞肉机绞，一般细胞并不破碎，而有的酶必须细胞破碎后才能有效地提取，因此须采用特殊的匀浆才行。在实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器。工业上可用高压匀浆泵。（2）反复冻融由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使某些酶释放出来。（3）丙酮粉组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中，真空干燥即

4、得丙酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年。2、微生物的预处理要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁，制成无细胞的悬液后再行提取。（1）干燥法干燥方法很多，常见有空气干燥、真空干燥和冷冻干燥三种。（2）机械法常用的方法有研磨法，组织匀浆法，超声波法，高压匀浆法等。（3）酶法处理用得最多的是溶菌酶，也有用脱氧核糖核酸酶处理，操作与溶菌酶同。（二）酶的提取一般在提取前，应通过调查研究，文献检索，详细了解欲提取酶的性质。提取方法主要有水溶液法，有机溶剂法和表面活性剂法三种。1、水溶液法常用稀盐溶液或缓冲

5、液提取。为了防止提取过程中酶活力降低，一般在低温下操作。2、有机溶剂法某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，用水溶液很难提取，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性。最常用的有机溶剂是丁醇。丁醇具有下述性能：①亲脂性强，特别是亲磷脂的能力；②兼具亲水性，在0℃在水中的溶解度为10.5％；③在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。3、表面活性剂法表面活性剂分子具有亲水性的或疏水性的原子基团。表面活性剂能与蛋白质结合而分散在溶液中，故可用于提取结合酶，但此法用得较少。（三）酶制剂的工业提取法工业生产的酶有二种剂型——液体制剂

6、和粉剂1、发酵液的预处理及过滤现在处理方法是，在发酵液中加絮凝剂或凝固剂。微生物发酵液的分离，过滤，常采用的设备是转鼓式真空吸滤机、离心沉降分离机和板框压滤机。2、酶液的脱色工业上廉价的脱色剂是活性炭，用量通常为0．1％～1．5％。目前工业上大规模使用脱色树脂国内生产的几种脱色树脂，效果都较好。3、盐析法盐析法的优点是在常温下不会造成酶的失活，若分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少，适用于多种酶沉淀。4、有机溶剂法用有机溶剂沉淀蛋白质及用分级沉淀法纯化蛋白质。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。5、喷雾干燥直接制各粉末酶制剂喷雾干燥有很大局限性

7、，尤其药用酶制剂都很难过温度这一关。喷雾干燥用于菌体干燥，而药用酶常用冷冻干燥。除上述方法外，工业上提取酶制剂的方法还有丹宁沉淀法、白土活性氧化铝吸附法、pH或加热沉淀法、蛋白质表面变性法等。（四）酶的纯化酶的纯化。评价主要看二个指标，一是酶比活，二是总活力回收。本节重点讨论酶在纯化过程中遇到的一些技术难点。1、杂质的除去酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、多糖、脂类和核酸等。（1）pH和加热沉淀法利用蛋白质酸碱变性性质的差别可以通过调pH和等电点除去某些杂蛋白，也可利用不同蛋白质对热稳定的差异，使杂蛋白变性而沉淀。（2）蛋白质

8、表面变性法利用蛋白质表面变性性质的差别，也可除去杂蛋白。例如：加入三氯甲烷和乙醇进行震荡，可以除去杂蛋白。（3）选择性变性法利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。甚至可用2．5％三氯乙酸处理，这时其他杂蛋白都